Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему: Роль регуляторных Т-клеток в иммунопатогенезе туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью

Автореферат диссертации по медицине на тему Роль регуляторных Т-клеток в иммунопатогенезе туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью

На правах рукописи

ЧУРИНА ЕЛЕНА ГЕОРГИЕВНА

РОЛЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор

Новицкий Вячеслав Викторович Уразова Ольга Ивановна

Агафонов Владимир Иванович Иванова Светлана Александровна Долгих Татьяна Ивановна

НИИ фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России, г. Москва, ул. Достоевского, д. 4

Защита состоится: 2012 г. в на заседании диссертационного

совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современных условиях туберкулез легких (ТБ) характеризуется тяжелым клиническим течением, патоморфозом, формированием множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ) к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП), выраженной функциональной недостаточностью иммунной системы пациента и высоким процентом летальных исходов [Комиссарова О.Г., 2011; Филинюк О.В., 2011; Jeon D.S. et al., 2011; Wells C.D., 2010; Мишин В.Ю. и соавт., 2009]. Следует отметить, что на сегодня МЛУ МБТ у впервые выявленных больных является глобальной общемировой проблемой. По данным ВОЗ (2010), основанным на информации, поступившей из 114 стран мира, первичная МЛУ МБТ составляет около 4 % от всех впервые выявленных случаев ТБ, а на территории стран СНГ данный показатель выше в 3 -6 раз [Филинюк О.В., 2011; Caminero J.А., 2010; WHO, 2010; Wright A. et al., 2009].

В основе патогенеза распространенного деструктивного ТБ лежит дисрегуля-ция антигенспецифического Thl-зависимого иммунного ответа [Orme I.M., 2011; Jacobsen M. et al., 2011; Темчура О.В. и соавт., 2007; Гунтупова Л.Д. и соавт., 2006; Raja А., 2004]. Однако по-прежнему остается открытым вопрос о том, включение каких механизмов иммунного ответа на МБТ и на каком его этапе способствует возникновению «иммунной девиации» и патологическому прогрессирующему течению туберкулезной инфекции.

В течение последнего десятилетия при исследовании особенностей иммуно-патогенеза инфекционных заболеваний, в том числе ТБ, особое внимание уделяется регуляторным Т-клеткам, которые обладают супрессорной активностью и таким образом способствуют снижению интенсивности протективного антигенспецифического иммунного ответа, направленного на эрадикацию патогенов различной природы [Miyara M., Sakaguchi S., 2011; Ярилин A.A., 2010; Koval'chuk L.V. et al., 2010; Курганова E.B. и соавт., 2008; Chen X. et al., 2007; Guyot-Revol V. et al., 2006; Железникова Г.Ф., 2006]. Предполагается, что опосредованное регуляторными Т-клетками угнетение антигензависимой дифференцировки ThO-лимфоцитов и кло-нальной экспансии Th-активированных и Thl-лимфоцитов лежит в основе формирования Т-клеточной и туберкулиновой анергии у больных ТБ [Wergeland I. et al., 2011; Но P. et al., 2010; Geffner L. et al., 2009; Сахно Л.В. и соавт., 2006, 2004]. На сегодняшний день сведения о роли регуляторных Т-клеток в патогенезе различных заболеваний немногочисленны. «Репертуар» регуляторных Т-клеток весьма разнообразен, однако конкретные механизмы, с помощью которых они реализуют свои иммуносупрессорные потенции, остаются неустановленными. Между тем известно, что Т-лимфоциты с иммунофенотипом CD4+CD25+, содержащие внутриклеточный транскрипционный фактор Foxp3 (Treg), отличаются от Thl-, Th2-, Thl7-, Трн-, Th-активированных клеток по спектру секретируемых цитокинов и способны супрессировать функции всех перечисленных клонов Т-хелперов, а также обеспечивать периферическую иммунологическую толерантность к аутоантигенам [Miyara M., Sakaguchi S., 2011; Sakaguchi S., 2011; Хаитов P.M. и соавт., 2011; Хайду-ков C.B., Зурочка А.В., 2011; Козлов В.А., 2010; Ярилин А.А., 2010; Lee D.C. et al., 2010].

Конверсия, индукция Treg и реализация ими супрессорных свойств опосредуются преимущественно иммунорегуляторными цитокинами - интерлейкином (IL) 2, IL-4, IL-10, интерфероном (IFN) у, трансформирующим фактором роста (TGF) р. Допускается также возможность прямого контактного взаимодействия Treg с клеткой-мишенью, влияние Treg на апоптоз и пролиферацию лимфоцитов [Klein S. et al., 2011; Hiinig Т. et al., 2010; Wu Y.E. et al., 2010; Sharma P.K. et al., 2010].

В иммунопатогенезе ТБ тесно взаимосвязаны механизмы врожденного и адаптивного иммунитета, посредниками которых считаются, в том числе, у5Т-клетки [Witherden D.A., Havran W.L, 2011; Xi X. et al, 2011; Spada E. et al, 2010; Beutler B, Hoffmann J., 2008; Moser В., Brandes M, 2006; Zhao H. et al, 2005; Steinman R.M, 2004]. Они играют решающую роль не только в реализации ответа «первой линии защиты» на патоген, но и выполняют регуляторные (иммуносу-прессорные) функции [Хаитов P.M. и соавт, 2011; Vigano P. et al, 2004; Roark C.L. et al, 2004].

В структуре цитокинов, секретируемых регуляторными Т-клетками, наиболее широким спектром супрессорного воздействия обладают TGF0, IL-10, IL-4 и IFNy [Симбирцев А.С, 2011; Miyara М, Sakaguchi S, 2007]. В настоящее время высказывается предположение о связи генетически детерминированной гипер- или ги-попродукции цитокинов с качеством иммунного ответа, тяжестью и продолжительностью инфекционных заболеваний [Абрамов Д.Д. и соавт, 2011; Коненков В.И. и соавт, 2011, 2010; Салина Т.Ю, Морозова Т.И, 2010; Шевченко А.В. и соавт, 2010; Saliu O.Y. et al, 2006; Hodak E. et al, 2005].

В свете указанных выше данных, актуальным аспектом проблемы иммунопа-тогенеза ТБ представляется поиск ключевых механизмов, обусловливающих супрессию противотуберкулезного иммунитета, оценка роли различных субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов и у8Т-клеток в ее формировании и, как следствие, дисрегуляции вторичного иммунного ответа. Понимание этого позволит не только определить новые фундаментальные механизмы патогенеза ТБ, но и разработать комплексные подходы к персонифицированной коррекции иммунодефи-цитных состояний, сопровождающих течение ТБ, а также сформировать теоретическую основу для создания современных методов прогноза и вакцинопрофилак-тики туберкулезной инфекции.

Цель исследования: установить механизмы иммуносупрессии и роль регуляторных Т-клеток в их реализации при туберкулезе легких с множественной лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis.

1. Оценить особенности субпопуляционного состава регуляторных Т-клеток и эффективность вторичного иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis у больных с впервые выявленным туберкулезом легких в зависимости от клинической формы заболевания, лекарственной чувствительности возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам и характера реакции Манту.

2. Выявить механизмы формирования иммуносупрессии при туберкулезе легких с множественной лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis.

3. Охарактеризовать иммуносупрессорные эффекты регуляторных Т-клеток при туберкулезе легких с лекарственной чувствительностью и множественной лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis.

4. Выявить иммуногенетические маркеры цитокинопосредованной супрессии иммунного ответа у больных туберкулезом легких на основе анализа функционального полиморфизма генов IL2 (T-330G), IL4 (С-590Т), IL10 (С-592А), IFNG (+874А/Т), TGFB (С-509Т).

5. Определить иммунологические параметры, позволяющие прогнозировать множественную лекарственную устойчивость Mycobacterium tuberculosis у больных с впервые выявленным туберкулезом легких.

Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное исследование этиопатогенетических факторов супрессии антигенспецифического иммунного ответа при различных клинических формах впервые выявленного распространенного деструктивного ТБ в зависимости от реакции на внутрикожное введение туберкулина (проба Манту) и чувствительности Mycobacterium tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) до начала специфической химиотерапии. Показано, что увеличение количества CD3+CD4+CD25+hi, а также ^охрЗ-позитивных CD4+CD25+ (Treg) и CD4+CD25

регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью у больных ТБ с положительной и отрицательной реакцией Манту ассоциировано со снижением числа Foxp3-негативных CD4+CD25+ Т-клеток в крови и гиперсекрецией in vitro цитокинов с противовоспалительной и иммуносупрессорной активностью (IL-4, IL-10, TGF(3). При этом указанные изменения более выражены при МЛУ фиброзно-кавернозном ТБ, а туберкулиновая анергия у больных диссеминированным и фиброзно-кавернозным ТБ сопряжена с МЛУ Mycobacterium tuberculosis к основным ПТП.

Наряду с этим у больных ТБ независимо от клинической формы заболевания, характера реакции Манту и чувствительности Mycobacterium tuberculosis к основным ПТП установлено увеличение численности CD3+CD4"CD25+ регуляторных Т-клеток при снижении количества у5Т-лимфоцитов в крови. Обнаружены разнонаправленные изменения содержания CD45R0+ Т-клеток памяти в крови у больных ТБ с наиболее выраженным снижением их количества (в 4,5 раза) при диссемини-рованном МЛУ ТБ с отрицательной реакцией Манту и максимальным увеличением (в 2,5 раза) при инфильтративном и фиброзно-кавернозном МЛУ ТБ.

Показано, что выявленные у больных МЛУ ТБ снижение активности спонтанной и PPD-индуцированной пролиферации и активация апоптоза лимфоцитов коррелируют с увеличением количества CD4+CD25+Foxp3+, CD3+CD4+CD25+hi, CD3+CD4

CD25+ регуляторных Т-клеток и снижением количества у5Т-клеток в крови.

С привлечением современных молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования проанализировано модулирующее влияние аллельного полиморфизма генов IL2, IL4, IL10, TGFB, IFNG на секрецию in vitro соответствующих иммунорегуляторных цитокинов при отдельных клинических формах ТБ. Показано, что частота встречаемости аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2, аллеля Т и генотипа ТТ (С-590Т) гена IL4, аллеля Т и генотипа ТТ (С-509Т) гена TGFB значимо выше при диссеминированном, чем при инфильтративном ТБ. Риск развития ТБ ассоциирован с генотипами GG (T-330G) гена IL2, СТ и ТТ (С-590Т)

гена IL4, АА (С-592А) гена IL10, ТТ (С-509Т) гена TGFB и АА (+874А/Т) гена IFNG. Выделены ключевые иммуногенетические факторы, опосредующие изменения секреции основных цитокинов-регуляторов иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis. В частности установлено, что гипосекреция IL-2 и гиперпродукция IL-10, TGFP и IL-4 in vitro обусловлены носительством аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2, аллеля А и генотипа АА (С-592А) гена IL10, аллеля Т и генотипа ТТ (С-509Т) гена TGFB и аллеля Г и генотипа ТТ(С-590Т) гена IL4.

В целом полученные данные свидетельствуют о том, что иммуносупрессия при ТБ с МЛУ МБТ опосредована повышением содержания CD4+CD25+Foxp3+, CD4+CD25"Foxp3+, CD3+CD4+CD25+hi, CD3+CD4

CD25+ субпопуляций регулятор-ных Т-клеток в крови, снижением количества циркулирующих у5Т-клеток, генетически детерминированной гиперпродукцией IL-4, IL-10 и TGF-P на фоне дефицита секреции IL-2 in vitro в ассоциации с лимфоцитопенией и подавлением пролифе-ративной реакции лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигеном. При этом су-прессорные эффекты регуляторных Т-клеток не исчерпываются секрецией медиаторов, ингибирующих антигенспецифический иммунный ответ, и реализуются за счет активации апоптоза и угнетения пролиферации эффекторных клонов Т-хелперов при диссеминированном и фиброзно-кавернозном ТБ. Впервые построена модель прогноза МЛУ ТБ по совокупности количественных показателей иммунного статуса пациента и показано, что наиболее информативными для прогноза МЛУ ТБ являются количество CD45R0+ Т-клеток памяти, CD3+CD4+CD25+hi и CD4+CD25+Foxp3" регуляторных Т-клеток, CD3+CD4+CD25

Т-хелперов в периферической крови.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные значительно расширяют представления об иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, вносят существенный вклад в понимание механизмов формирования супрессии иммунного ответа, развития и прогрессирующего течения инфекционного процесса у больных с распространенным деструктивным ТБ с МЛУ Mycobacterium tuberculosis.

Результаты исследования субпопуляционного состава регуляторных Т-клеток крови и секреции in vitro провоспалительных и противовоспалительных (с супрес-сорной активностью) цитокинов в ассоциации с аллельным полиморфизмом им-мунорегуляторных генов (IL2, IL4, IL10, TGFB и IFNG) представляются важными для формирования знаний о взаимосвязи генетического полиморфизма человека с развитием ТБ, позволяют глубже проникнуть в этиопатогенез данной патологии.

Полученные результаты теоретически обосновывают необходимость включения мероприятий по иммунокоррекции, направленной на регуляцию иммунного ответа в целях инактивации механизмов иммуносупрессии и устранения патологической «иммунной девиации», в стандартную программу лечения больных туберкулезом легких. В связи с этим целесообразным и перспективным представляется применение иммуномодуляторов, нормализующих баланс регуляторных и эффекторных клеток-участников иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis, имму-ноактивных препаратов, стимулирующих факторы протективного врожденного иммунитета, а также методов цитокиновой, антицитокиновой и клеточной иммунотерапии в качестве патогенетически обоснованного лечения больных туберкулезом легких.

Разработанная математическая модель прогноза, основанная на оценке количественных показателей иммунного статуса пациента, позволяет прогнозировать МЛУ МБТ у больных туберкулезом легких при выявлении заболевания и применять меры коррекции лечебного воздействия. Положения диссертации могут служить базисом не только для дальнейшего детального изучения иммунопатогенеза туберкулезной инфекции, но и для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения и исходов ТБ, что наиболее значимо у пациентов с туберкулиновой анергией и МЛУ возбудителя (особенно в случае диссеминированной и фиброзно-кавернозной форм заболевания).

Положения, выносимые на защиту:

1. При туберкулезе легких дисбаланс субпопуляционного состава регулятор-ных Т-лимфоцитов крови проявляется увеличением количества ^охрЗ-позитивных CD4+CD25+ и CD4+CD25 Т-клеток с иммуносупрессорной активностью и CD3+CD4+CD25+hi, CD3+CD4'CD25+ Т-лимфоцитов в условиях дефицита CD4+CD25+Foxp3

и убТСЯ-экспрессирующих Т-клеток. У больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) Mycobacterium tuberculosis и отрицательной реакцией Манту (туберкулиновой анергией) указанные изменения более выражены, чем у больных лекарственно-чувствительным туберкулезом легких и положительной реакцией Манту.

2. Вариабельность эффективности вторичного иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis связана с увеличением количества CD45R0+ Т-клеток памяти при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких и туберкулезе легких с МЛУ Mycobacterium tuberculosis и снижением содержания CD45R0"1" Т-лимфоцитов в крови у больных туберкулезом легких с туберкулиновой анергией.

3. Ведущими патогенетическими факторами иммуносупрессии при туберкулезе легких с МЛУ Mycobacterium tuberculosis являются: дефицит секреции IL-2 in vitro и увеличение количества в крови регуляторных Т-клеток, содержащих внутриклеточный транскрипционный фактор Foxp3, Т-лимфоцитов с высокой экспрессией молекулы CD25 и С04-негативных регуляторных Т-клеток, ассоциированное с активацией апоптоза и подавлением пролиферативной реакции лимфоцитов; генетически детерминированная и опосредованная увеличением количества регуляторных Т-клеток в крови гиперпродукция in vitro IL-4, IL-10, TGFß. Данные изменения, учитывая дефицит циркулирующих у5Т-клеток «первой линии защиты» на фоне дисрегуляции вторичного иммунного ответа, свидетельствуют о наличии у больных туберкулезом легких с МЛУ Mycobacterium tuberculosis многокомпонентной функциональной недостаточности иммунной системы.

4. Дисбаланс продукции иммунорегуляторных цитокинов in vitro у больных туберкулезом легких ассоциирован с аллельным полиморфизмом их генов: гипо-секреция IL-2 определяется носительством аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена 1L2, а увеличение продукции цитокинов с супрессорной активностью IL-4, IL-10 и TGFß - носительством аллеля Т и генотипа TT (С-590Т) гена IL 4, аллеля А и генотипа^ (С-592А) гена ILIO, аллеля Ти генотипа ТТ(С-509Т) гена TGFB.

5. Согласно модели прогноза варианта туберкулеза легких (лекарственно-чувствительный или МЛУ), построенной на основе пошагового дискриминантного анализа, высоко информативным при предсказании МЛУ Mycobacterium

tuberculosis у впервые выявленных больных туберкулезом легких является комплексное определение показателей, характеризующих содержание CD45R0+ Т-клеток памяти, CD3+CD4+CD25+hi и CD4+CD25+Foxp3" регуляторных Т-клеток, CD3+CD4+CD25" Т-хелперов в крови.

Реализация и апробация материала работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Euromedica Hannover 2008. Internationaler congress & fachmesse. Modern aspekte der prophylaxe, behadlung und rehabilitation (Hannover, 2008), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2009» (Санкт-Петербург, 2009), Российской научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), VIII Международной российско-германской научно-практической конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекционные заболевания» (Новосибирск,

2009), XV и XVI межгородских конференциях молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010), XI Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), IX Российско-германской конференции форума Коха - Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск,

2010), Всероссийской научной конференции «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010), 41st Union World Conference on Lung Health (Берлин, 2010), на Президиуме CO РАМН (Новосибирск,

2011), на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2008 - 2011), на научных семинарах кафедр патофизиологии, иммунологии и аллергологии, фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2008 - 2011).

Исследования проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2013 годы» (ГК №02.512.11.2112 «Молекулярно-генетические основы управления адаптационной реактивностью системы крови человека при инфекции», руководитель - академик РАМН, профессор В.В. Новицкий; ГК №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких», руководитель - профессор О.И. Уразова), РФФИ (11-04-98057-р «Разработка комплекса иммунодиагностиче-ских биомаркеров для оптимизации лечения больных туберкулезом легких», руководитель - профессор О.И. Уразова).

Внедрение. Результаты, основные положения и выводы диссертации внедрены в учебный процесс в ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России на кафедрах патофизиологии (в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Воспаление»), иммунологии и аллергологии (в тематических разделах «Функциональная организация иммунной системы», «Регуляция иммунных процессов», «Иммунный статус человека», «Вторичные иммунодефицита», «Аллергические заболевания»), фтизиатрии и пульмонологии (в тематических разделах «Иммунитет и аллергия при туберкулезе», «Патофизиология туберкулезного воспаления»).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 34 научных работы, из них 22 - в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 299 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 48 таблицами. Список литературы содержит 529 наименований, из них 247 отечественных и 282 иностранных источников.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке идеи, дизайна и планировании исследования. Результаты достигнуты, проанализированы и обобщены в выводах и положениях лично автором.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика клинического материала

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 338 больных с распространенными деструктивными формами впервые выявленного туберкулеза легких (ТБ) (248 мужчин и 90 женщин в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст - 47±11 лет). Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач - канд. мед. наук Г.В. Янова) во фтизиотерапевтических отделениях №1 (зав. отд. - О.И. Новосельцева), №2 (зав. отд. - Т.З. Малиновская).

Диагноз ТБ устанавливался на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты. У всех обследованных пациентов отмечался распространенный (более 4 сегментов) деструктивный характер поражения легочной ткани с вовлечением в патологический процесс преимущественно обоих легких. Инфильтративный туберкулез легких (ИТБ) был диагностирован у 209 (61,8 %) пациентов, диссеминированный туберкулез легких (ДТБ) - у 89 (26,6 %), фиброзно-кавернозный туберкулез легких (ФКТБ) - у 40 (12 %) (табл. 1).

Возбудитель туберкулеза выявляли методом прямой световой микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю - Нильсену, а также методом люминесцентной микроскопии с использованием флуорохромов (аурамина). Бактериовы-деление регистрировалось в 100 % случаев заболевания. Для видовой идентификации микобактерий туберкулеза (МБТ) и определения чувствительности к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) произво-

дили посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна - Йенсена и Финн-2. Исследования проводились в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач - канд. мед. наук Г.В. Янова) и Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач -С.П. Мишустин).

У 178 обследованных больных ТБ (99 пациентов с ИТБ, 49 больных ДТБ и 30 больных ФКТБ) была определена лекарственная чувствительность возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП). По данному критерию было выявлено 98 пациентов, выделяющих МБТ, чувствительные к основным ПТП, и 80 пациентов, выделяющих МБТ, устойчивые к препаратам основного ряда (изо-ниазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу) (табл. 1).

У 140 обследованных больных ТБ проводилось внутрикожное введение туберкулина (реакция Манту) в объеме 0,1 мл раствора, содержащего 2 туберкулиновых единицы (ТЕ). В связи с тем, что при статистической обработке результатов не было выявлено значимых различий между группами больных с гиперергиче-ской и нормергической реакцией на туберкулин, их было решено объединить в одну группу с «положительной реакцией на туберкулин». Соответственно по аналогичной причине была сформирована группа пациентов с сомнительной и отрицательной реакцией Манту («отрицательная реакция на туберкулин»). Таким образом, было выделено 94 пациента с «положительной» (нормергической и гиперер-гической) реакцией на туберкулин и 46 пациентов с «отрицательной» (сомнительной и отрицательной) реакцией на туберкулин (табл. 1).

Распределение больных туберкулезом легких (ТБ) по группам исследования

Принципы деления больных ТБ на группы исследования ИТБ ДТБ ФКТБ Всего

Всего пациентов 209 89 40 338

По чувствительности возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам С лекарственно-чувствительным ТБ 57 27 14 98

С множественно лекарственно-устойчивым ТБ 42 22 16 80

По реакции на внутрикожное введение туберкулина С положительной (нормо- и ги-перергической)реакцией 61 25 8 94

С отрицательной (сомнительной и отрицательной) реакцией 14 16 16 46

Примечание. Здесь и далее в таблицах: ТБ - туберкулез легких, ИТБ - инфильтратив-ный ТБ, ДТБ - диссеминированный ТБ, ФКТБ - фиброзно-кавернозный ТБ.

Группу сравнения составили 118 здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту, не имеющих в анамнезе хронических соматических (в том числе аутоиммунных) заболеваний и аллергических реакций, заболеваемость которых острыми респираторными инфекциями составляла не чаще 2-3 раз в год.

Все пациенты с легочным туберкулезом были обследованы при поступлении на стационарное лечение до назначения терапии.

Критерием включения в исследование было наличие у впервые выявленных больных инфильтративного, диссеминированного и фиброзно-кавернозного ТБ. В исследование не включались: больные, получавшие на момент исследования терапию противотуберкулезными, нестероидными противовоспалительными препаратами и глюкокортикостероидами; больные с тяжелыми сопутствующими заболеваниями (онкопатология, сахарный диабет, бронхиальная астма); больные с им-мунозависимыми, в том числе аутоиммунными и аллергическими заболеваниями, инфицированные вирусами гепатита и ВИЧ; больные, которым применялась иммунотерапия.

В связи с запланированным дизайном исследования и установлением имму-нопатогенетических взаимосвязей между многочисленными параметрами из общего числа обследованных пациентов с ТБ были сформированы три группы. В первой группе пациентов изучались различные субпопуляции регуляторных Т-клеток, их функциональная активность, а также отдельные параметры врожденного и адаптивного иммунного ответа, опосредованные прямым или косвенным влиянием регуляторных Т-клеток для установления их роли в иммунопатогенезе ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Данную группу составили 140 пациентов, которые подразделялись на подгруппы по клинической форме ТБ (75 пациентов с ИТБ, 41 - с ДТБ и 24 - с ФКТБ), по лекарственной чувствительности возбудителя к основным ПТП (78 пациентов, выделяющих МБТ, чувствительные к основным ПТП, и 62 пациента, выделяющих МБТ, устойчивые к препаратам основного ряда) и по реакции на внутрикожное введение туберкулина (94 пациента с положительной реакцией на туберкулин и 46 - с отрицательной реакцией на туберкулин).

Во второй группе пациентов оценивались пролиферация и апоптоз лимфоцитов крови. Данную группу составили 38 пациентов с ТБ, в основу деления которых на подгруппы были положены два принципа: клиническая форма ТБ (24 пациента с ИТБ, 8 - с ДТБ и 6 — с ФКТБ) и лекарственная чувствительность возбудителя к ПТП (20 пациентов, выделяющих МБТ, чувствительные к основным ПТП, и 18 пациентов, выделяющих МБТ, устойчивые к препаратам основного ряда).

В третьей группе пациентов нами проводилась оценка аллельного полиморфизма иммунорегуляторных генов цитокинов для выявления молекулярно-генетических механизмов дисбаланса иммунного ответа на М. tuberculosis. В данном случае для решения поставленной задачи была сформирована общая группа больных ТБ (160 человек), в которую включались больные со всеми исследованными клиническими формами ТБ (инфильтративной, диссеминированной, фиб-розно-кавернозной). Оценка ассоциаций носительства отдельных полиморфизмов иммунорегуляторных генов с конкретной клинической формой ТБ и изменениями цитокинопродукции in vitro при отдельных клинических формах ТБ проводилась на примере подгруппы больных с ИТБ (110 человек) и ДТБ (40 человек). Пациенты с ФКТБ (10 человек) в виду их малочисленности не были включены в иммуно-генетическое исследование.

Материалом исследования являлась периферическая венозная кровь, взятая у здоровых доноров и у больных ТБ до назначения специфической химиотерапии, а также супернатанты культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов крови. Кровь забирали утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл. Исследования проводились в Центральной научно-исследовательской лаборатории (зав. -д-р мед. наук, профессор А.Н. Байков) и в лаборатории экспериментальной патофизиологии кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

• Проведение пробы Манту (приказ Минздрава РФ № 229 от 27 июня 2001 года).

• Исследование секреции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови in vitro:

- Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови по методу Е.Д. Гольдберга и соавт. [1992].

- Определение содержания IL-2, IL-4, IL-10, IFNy и TGF0 в супернатантах культуральных суспензий методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

• Определение иммунологических фенотипов регуляторных Т-клеток крови методом проточной цитометрии:

- Определение поверхностных молекул CD4, CD25 и внутриклеточного маркера иммуносупрессорной активности Foxp3 в лимфоцитах периферической крови методом проточной лазерной трехцветной цитометрии с использованием моно-клональных антител (МКАТ), меченных флуоресцентными метками («Becton Dickinson (BD)», США).

- Определение поверхностных молекул CD3, CD4 и CD25 на лимфоцитах периферической крови методом проточной лазерной трехцветной цитометрии с использованием МКАТ, меченных флуоресцентными метками («Becton Dickinson (BD)», США).

- Определение количества ySTCR-презентирующих лимфоцитов в периферической крови методом лазерной проточной трехцветной цитометрии с использованием МКАТ Anti-TCR-y/8-l, меченных флуоресцентными метками («Becton Dickinson (BD)», США).

• Определение лимфоцитов крови, экспрессирующих маркер CD45R0, методом лазерной проточной трехцветной цитометрии с использованием МКАТ Anti-CD45R0, меченных флуоресцентными метками («Becton Dickinson (BD)», США).

• Оценка спонтанной и индуцированной пролиферации лимфоцитов крови по методу, предложенному J. Carmichael [1987], основанному на трансформации лимфоцитов в культуральной среде под влиянием митогенов или антигенов в лимфобласты, оцениваемой по изменению цвета, связывающегося с клетками красителя 3-[4,5-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ, тиазо-лил синий) из синего в желтый.

• Оценка пролиферации и апоптоза лимфоцитов крови методом проточной цитометрии по определению популяции клеток, несущих фрагментированную ДНК, и популяции клеток, несущих тотальную ДНК, основанном на реакции, катализируемой экзогенной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT), функция которой заключается в случайном добавлении бромированного дезоксиуридинтрифос-фата (Br-dUTP) к свободным З'-ОН-концам фрагментов двухцепочечной и одно-цепочечной ДНК.

• Выделение ДНК из периферической крови согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия).

• Исследование полиморфных участков генов цитокинов с использованием аллельспецифичной амплификации специфических участков генома [Кофиади И.А, 2006].

• Статистический анализ результатов исследования.

Анализ первичных данных проводили с применением методов статистического описания и проверки статистических гипотез. Все количественные показатели проверяли на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро -Уилкса. Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (Я"), среднее квадратичное отклонение (о), ошибку среднего (т). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (М), первый и третий квартили

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎