Поражения конъюнктивы и переднего эпителия роговицы глаза при гипоксии (экспериментальные исследования)

Гипоксия стоит в ряду серьезных повреждающих орган зрения факторов внешней среды, с которыми современный человек сталкивается в повседневной жизни. Это связано, прежде всего, с негативным влиянием некоторых производств, последствием природных катастроф и антропогенных факторов. Гипоксия играет важную роль в патогенезе синдрома сухого глаза, наследственных, дистрофических, ишемических, воспалительных, инфекционных и других заболеваний глазного яблока [1, 2]. При гипоксии нарушаются условия поддержания нормального метаболизма и функционирования клеток, что может приводить к их гибели. При многих заболеваниях глаза у человека: глаукоме, катаракте, диабетической ретинопатии, дистрофии сетчатки – наблюдается гибель клеток по механизму апоптоза [3–10].

Экспериментальное исследование влияния гипоксии на апоптотическую гибель клеток проводилось на отдельных тканях глаза в условиях in vitro. В частности, в культуре очищенных ганглиозных клеток сетчатки крыс, а также кератоцитах роговицы показано: гипоксия индуцирует апоптоз в этих клетках [11, 12].

Ранее на лабораторных животных при острой гипоксии было установлено, что апоптотическое повреждение клеток избирательно происходит в переднем эпителии роговицы и конъюнктивы. В других тканях глаза – хрусталике, радужке, цилиарном теле, хориоидее и в сетчатке – апоптотические клетки отсутствовали. Острую гипоксию создавали путем откачивании воздуха в течение 1 минуты до достижения в барокамере давления, равного 180 мм рт.ст. В этих условиях крысы находились в течение 3 минут. Результаты опытов регистрировали через 3 часа (положительное решение по заявке на изобретение «Способ моделирования гипоксического поражения тканей глаза с активацией апоптоза» от 02.02.2017 г.).

В настоящем исследовании влияние гипоксии на глазные ткани изучали in vivo в условиях острой гипобарической гипоксии при замещении воздуха в герметической камере азотом.

Цель – изучение влияния гипоксии на распределение апоптотических клеток в тканях глаза взрослых крыс в условиях моделирования ишемического поражения при острой гипобарической гипоксии в барокамере.

Материал и методы

Проведено экспериментальное моделирование острой гипоксии на 20 половозрелых самцах крыс Wistar, в возрасте 3–4 месяцев (10 крыс – из опытной группы, 10 крыс – из контрольной). Животных подвергали однократному воздействию острой гипоксии, которая достигалась путем замещения воздуха азотом из герметической камеры объемом 0,12 м3, куда помещались подопытные животные на 7–10 минут, до возникновения судорог. Глаза животных опытной группы анализировали через три часа после гипоксического воздействия. Контрольная группа животных, которые не подвергались гипоксии, содержалась в условиях комнатной температуры. Эксперименты проводили в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, а также положениями Европейской конвенции о защите животных, используемых для научных целей.

Животных выводили из эксперимента путем наркотизации в эфире, после чего у крыс изолировали глаза, проводили их гистологическое исследование с проведением последующего анализа по распределению в тканях глаза апоптотических клеток. Для выявления последних применяли традиционный метод TUNEL (Terminal desoxynucleotidyl transferase – mediated desoxyuridine triphosphate (UTP) – nick end – labeling), используя набор реагентов «DeadEnd Fluorometric TUNEL System» (Promega Corporation, USA).

Для выполнения гистологического исследования материал для световой микроскопии обрабатывался общепринятыми гистологическими методами. Глаза крыс фиксировали в жидкости Буэна, заливали в парафин и использовали для приготовления срезов согласно стандартному протоколу [13]. Срезы толщиной 7 мкм приклеивали на стекла с адгезивным покрытием (Silane – Prep Slides, Sigma) и после депарафинирования срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты исследовали под световым микроскопом фирмы Leiсa (Германия).

Подготовка материала и проведение реакции мечения ДНК по методу TUNEL проводилась в следующем порядке. Глаза фиксировали в 4%-ном нейтральном формалине, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рH 7.4) в течение 4 ч. Затем образцы отмывали в фосфатном буфере, в трех сменах его с 5% сахарозой, после чего с 10% сахарозой и 20% сахарозой (в каждом растворе по 15 минут) и оставляли на ночь в фосфатном буфере с 20% сахарозой при 4°C. После замораживания глаз в специальной среде (Tissue-Tec ОСТ, Leica, Германия), с помощью криостата (Leica M1900, Германия), были получены поперечные срезы глазного яблока и отобраны для анализа. Толщина срезов составляла 12 мкм.

Мечение фрагментированной ДНК по методу TUNEL проводили по протоколу фирмы-производителя. Перед проведением энзиматической реакции, срезы отмывали в 0,1 М PBS, фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 5 минут, затем отмывали от фиксатора в 0.1 М PBS трижды в течение 5 минут. Реакцию проводили в течение часа при температуре 37°С, затем ее останавливали путем отмывания срезов в 2-x кратном растворе SSC. Для подтверждения специфичности реакции также проводили стандартную контрольную реакцию в отсутствие фермента rTdT. Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342, разведенном в 0,1 М PBS (1:1000, Leica, Германия), в течение двух минут. После окрашивания срезы отмывали в нескольких сменах 0,1 М PBS, по 15 минут в каждом растворе, и заключали в специальную среду для препаратов с флуоресцентной меткой – Vectashield (Vector, США).

Микроскопия и компьютерный анализ изображения был основан на локализации флуоресцентного свечения и оценке его интенсивности в клетках тканей глаза с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM RXA2 (Германия) с передачей изображения на компьютерную приставку, оснащенную программой Leica for Windows. Изображения обрабатывали с помощью компьютерной программы Image J.

Результаты и обсуждение

Просмотр отобранных поперечных срезов для анализа распределения апоптотических клеток в тканях глаза отчетливо показал, что в условиях экспериментальной гипоксии первичное поражение происходит, главным образом, в клетках переднего эпителия роговицы и конъюнктивы, что приводит к апоптотической гибели значительной их части. Окраска красителем ДНК Hoechst 33342 подтверждает локализацию апоптоза в ядрах клеток. В других тканях глаза – хрусталике, радужке, цилиарном теле, хориоидее, апоптотические клетки отсутствовали при данном типе поражения. На всех изученных глазах наблюдали одинаковую картину. В исследуемых же тканях глаза животных из контрольной группы (без воздействия гипоксии) встречались лишь единичные апоптотические клетки в конъюнктиве и переднем эпителии роговицы. В контрольных препаратах, служивших отрицательным контролем для подтверждения специфичности реакции в опыте, меченых клеток не наблюдали.

Таким образом, гипоксия вызывает интенсивный процесс фрагментации ДНК и апоптоза в клетках тканей передней поверхности глаза.

Ранее в экспериментах острой гипобарической гипоксии было показано, что апоптотическое повреждение клеток встречается только в области передней поверхности глазного яблока – в эпителии роговицы и конъюнктивы. В настоящем исследовании на модели острой гипоксии при замещении воздуха в герметической камере азотом также установлено избирательное повреждение передней поверхности глаза.

На наш взгляд, на указанных экспериментальных моделях возможно исследование фундаментальных механизмов эффективности определенных лекарственных препаратов в лечении заболеваний глаз.

Исследования показали, что клетки глазной поверхности у лабораторных животных характеризуются чувствительностью к повреждающему воздействию гипоксии, которая приводит к фрагментации ДНК, апоптотической гибели клеток конъюнктивы и переднего эпителия роговицы.