Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему: Влияние ауторегуляторных факторов бактерий (гомосеринлактонов и алкилоксибензолов) на лейкоциты периферической крови человека

Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние ауторегуляторных факторов бактерий (гомосеринлактонов и алкилоксибензолов) на лейкоциты периферической крови человека

На правах рукописи

СВИРИДОВА ТАТЬЯНА ГЕННАДЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ АУТОРЕГУЛЯТОРИЫХ ФАКТОРОВ БАКТЕРИЙ

(ГОМОСЕРИНЛАКТОНОВ И АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ) НА ЛЕЙКОЦИТЫ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

14.03.09-клиническая иммунология, аллергология

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре микробиологии ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»

доктор медицинских наук, профессор Дерябин

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунологии и воспаления ФГБУН Института иммунологии и физиологии УрО РАН

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунорегуляции ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Куклина Елена Михайловна

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет» ФГБОУ ВПО «ЧелГУ», г. Челябинск.

Защита диссертации состоится «¿7.» Ю>аЦ4 2013 года в Ю-СО часов на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, соискание ученой степени доктора наук Д 004.027.01 при ИИФ УрО РАН (620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН, с авторефератом - на сайте ИИФ УрО РАН и ВАК РФ http://vak2.ed.gov.ru.

Автореферат диссертации разослан «АЗ » 2013 г.

Ученый секретарь Совета Д 004.027.01

при ИИФ УрО РАН,

•доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Функциональная активность лейкоцитов периферической крови человека находится под множественным контролем эндогенных и экзогенных факторов различного генеза, включая продукты микробного происхождения (Хаитов P.M., 2000). Среди последних всё большее внимание привлекают малые молекулы (англ. — small molecules originating from microbes), которые в силу особенностей своего строения относительно легко проникают через барьерные структуры, плохо метаболизируются и, как следствие, вовлекаются в регуляцию микробно-иммунологических взаимоотношений в организме хозяина (Hughes D., 2008). В частности, к таким соединениям могут быть отнесены две группы ауторегуляторных факторов - гомосеринлактоны (Ng W., 2009) и алкилоксибензолы (Stasiuk М., 2010), синтезируемые обширной группой сапротрофных и симбиотрофных бактерий. Доказательством возможности их участия в регуляции активности иммунной системы человека и животных является экспериментально зафиксированное присутствие гомосеринлактонов и алкилоксибензолов в крови и тканях человека в нано- и микромолярных концентрациях (Miyairi S., 2006; Ross А., 2012).

Иммуномодулирующая активность гомосеринлактонов (ГСЛ) наиболее детально изучена на примере 3-оксо-С12-ГСЛ - ключевого регулятора «чувства кворума» у Pseudomonas aeruginosa (Jarosz L., 2011), спектр регистрируемых биологических активностей которого включает: угнетение цитопролиферации и цитодифференцировки (Ritchie А., 2005), изменение продукции интерлейкинов (Gomi К., 2006) и экспрессию поверхностных рецепторов лейкоцитов (Lu Q., 2012). Для алкилоксибензолов (АОБ), контролирующих переход микроорганизмов в гипометаболическое состояние (Эль-Регистан Г.И., 2006), наиболее детально охарактеризованы влияние на результативность взаимодействия в системе «антиген-антитело» (Романенко H.A., 2011) с сопутствующим изменением размерных характеристик образующихся иммунных комплексов (Королевская Л.Б, 2012), а также влияние на розеткообразующие и адгезивные свойства лимфоцитов (Казацкая Ж.А, 2012).

Однако до настоящего времени сравнительные исследования иммуномодулирующих активностей ГСЛ и АОБ, в том числе ориентированные на выявление их участия в определении жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов, не проводились. При этом, особый интерес представляют:

1) определение основных последствий воздействия ГСЛ и АОБ на лейкоциты; 2) сравнение механизмов биологической активности ГСЛ и АОБ; 3) выявление зависимости регистрируемых эффектов от особенностей их химической структуры и действующих концентраций. Ответы на эти вопросы позволят приблизиться к пониманию сетевых взаимодействий в симбиотико-паразитарных системах, а также определить новые возможности иммунорегуляции.

Цель работы - исследовать влияние низкомолекулярных бактериальных ауторегуляторов из групп гомосеринлактонов (ГСЛ) и алкилоксибензолов (АОБ) на жизнеспособность и некоторые функциональные характеристики лейкоцитов периферической крови человека.

1. Выявить гомологи ГСЛ и АОБ и их эффективные концентрации, оказывающие цитотоксическое действие на лейкоциты периферической крови человека, и определить механизмы этой активности.

2. Оценить эффекты ГСЛ и АОБ на процессы спонтанной и индуцируемой при фагоцитозе секреторной дегрануляции нейтрофильных лейкоцитов, а также влияние АОБ на их поглотительную функцию.

3. Изучить влияние ГСЛ и АОБ на окислительный метаболизм нейтрофильных лейкоцитов при фагоцитозе в тесте люминол-зависимой хемилюминесценции с анализом роли в этом процессе антиоксидантных и фермент-модифицирующих свойств бактериальных ауторегуляторных молекул.

4. Определить влияние ГСЛ и АОБ на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов ФНО-а, ИЛ-1(3 и ИЛ-10 моноцитами периферической крови человека.

Научная новизна. Впервые дана комплексная сравнительная характеристика биологических эффектов представительного ряда бактериальных ауторегуляторных молекул из групп гомосеринлактонов и алкилоксибензолов на жизнеспособность и функциональные характеристики лейкоцитов периферической крови человека.

Установлен цитотоксический эффект высоких (миллимолярных) концентраций ГСЛ и АОБ в отношении лейкоцитов периферической крови человека, выраженность которого возрастает с увеличением размера неполярного углеводородного радикала в структуре данных молекул. На примере наиболее биологически активных длинноцепочечных гомологов показано, что цитотоксический эффект С12-ГСЛ связан с индукцией гибели клеток по пути апоптоза, а у С12-АОБ определяется дестабилизацией цитоплазматических мембран.

Впервые установлено подавление секреторной активности лейкоцитов после их предварительной обработки ГСЛ и ЛОБ, а также сопряженное с этим угнетение поглотительной способности нейтрофилов при воздействии ЛОБ. Показано, что природа подобных эффектов бактериальных ауторегуляторов в миллимолярных концентрациях оказывается ассоциированной с их цитотоксичностыо, а при переходе в диапазон микромолярных концентраций реализуется как умеренно выраженный эффект гипоактивации фагоцитирующих клеток.

Впервые выявлена способность ГСЛ и ЛОБ к подавлению «респираторного взрыва» нейтрофилов при фагоцитозе, зарегистрированному как в цитотоксическом, так и субцитотоксическом диапазоне воздействующих концентраций. В тесте люминол-зависимой хемилюминесценции показано, что действие ГСЛ и ЛОБ в значительной степени определяется ингибированием ферментов окислительного метаболизма лейкоцитов и, в меньшей степени, собственными про- или антиоксидантными свойствами бактериальных ауторегуляторов.

Охарактеризовано дозозависимое снижение продукции про- (ФНО-а) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов моноцитами периферической крови человека после их обработки субцитотоксическими концентрациями ГСЛ и ЛОБ при относительной устойчивости к подобному воздействию ИЛ-ф. Подавление продукции цитокинов несколько более выражено в присутствии ГСЛ, нежели ЛОБ, а внутри этих групп прогрессировало с увеличением размера углеводородного радикала в их молекулах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы определяется расширением представлений о сетевых взаимодействиях в симбиотико-паразитарных системах, в том числе реализуемых посредством малых молекул бактериального происхождения. Выявленный комплекс эффектов бактериальных ауторегуляторов (ГСЛ и ЛОБ) в отношении лейкоцитов периферической крови человека позволил сформировать представления о них как полимодальных молекулах, выполняющих у образующих их микроорганизмов важные коммуникативные и адаптогенные функции, а при взаимодействии с эффекторами иммунной системы человека обусловливающих развитие ряда цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов.

Полученные результаты могут быть привлечены для объяснения феномена гипоактивации иммунитета с нарушением функционирования его клеточного звена при инфекционных и дисбиотических состояниях, в том числе определяемого с проявлением биологической активности диффундирующих во внутреннюю среду

макроорганизма бактериальных ауторегуляторов.

Практическая значимость работы определяется выявлением у ГСЛ и АОБ ряда иммуномодулирующих активностей, что позволяет рассматривать их индивидуальные гомологи в качестве кандидатных препаратов для терапии состояний, сопровождающихся выраженной гиперактивацией клеточного звена иммунитета.

Дополнительным практически-ориентированным результатом исследования является разработка оригинального метода оценки активности бактериолитических ферментов, в том числе в процессе их секреторной дегрануляции лейкоцитами (Патент РФ на изобретение № 2410436 «Способ определения чувствительности бактерий к действию бактериолитических ферментов - лизоцима или лизостафина»).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гомосеринлактоны и алкилоксибензолы в миллимолярных концентрациях проявляют цитотоксическое действие, более выраженное в отношении гранулоцитов и менее - в отношении мононуклеарных лейкоцитов. Механизм цитотоксического действия ГСЛ связан с индукцией апоптоза лейкоцитов, в то время как АОБ вызывают гибель клеток через дестабилизацию цитоплазматических мембран.

2. Гомосеринлактоны и алкилоксибензолы в субтоксическйх микромолярных концентрациях подавляют вызванную фагоцитозом или воздействием липополисахаридов активацию лейкоцитов, что включает снижение эффективности секреторной дегрануляции и поглотительной способности, угнетение окислительного метаболизма, а также ингибирование продукции цитокинов. Эффект гипоактивации лейкоцитов более выражен при воздействии ГСЛ, нежели АОБ, а внутри этих групп возрастает с увеличением длины углеводородного радикала в их молекулах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (Государственное задание на выполнение НИР №4.2312.2011 «Исследование эффектов бактериальных ауторегуляторов (алкилоксибензолов и гомосеринлактонов) в гомологичных и гетерологичных системах»), а также Российского фонда фундаментальных исследований (Грант № 11-04-12057-офи-м-2011 «Разработка научно обоснованной концепции модификации антител и клеточной иммунорегуляции с использованием химических аналогов алкилоксибензолов микробного и растительного происхождения»).

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Автор благодарит сотрудников Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН д.м.н., проф. К.В. Шмагеля и C.B. Слободчикову за помощь в исследовании поглотительной активности лейкоцитов.

Апробация работы, внедрение и публикации. Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 201]), VII молодёжной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012). Полученные данные используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет» по дисциплине: «Иммунология».

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 1 статья в зарубежном журнале,- входящем в международную систему цитирования Scopus; получен 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы из 169 наименований отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 21 рисунком.

Материалы и методы исследований. При проведении исследований использованы химические аналоги микробных ауторегуляторов -гомосеринлактоны и алкилоксибензолы, со степенью очистки 99.9%, различающиеся длиной углеводородных радикалов (рисунок 1).

Рисунок 1 - Структурные формулы использованных ГСЛ п ЛОБ.

Примечание: п = 0, 4 или 10 для ГСЛ; т = 0, 5 или 11 для АОБ; х - нет радикала в

молекуле ГСЛНС1; у - углеводородный радикал в о/даю-положении в молекуле Сб-АОБ.

Гомолога ГСЛ были представлены препаратами: L-гомосеринлактона гидрохлоридом (ГСЛ-НС1) (Sigma, США), Ы-гексанои.т-ОЬ-гомосеринлактоном (С6-

ГСЛ) и Ы-додеканоил-ОЬ-гомосеринлактоном (С12-ГСЛ) (Fluka, Германия). Ряд гомологов АОБ включал: метилоксибензол (СгАОБ), гексилоксибензол (С6-АОБ) (Sigma, США) и додецилоксибензол (С12-АОБ) (Enamine, Украина). Непосредственно перед проведением экспериментов готовили серии водных растворов исследуемых веществ (в случае С6- и С12-ГСЛ и С12-АОБ в 5% этаноле).

Лейкоциты периферической крови человека выделяли при центрифугировании в двойном градиенте «фиколл : верографин».

Цитотоксичность ГСЛ и АОБ в отношении лейкоцитов оценивали в тесте с красителем трипановым синим (ТС) в камере Горяева, отмечая погибшие голубые (ТС+) и живые неокрашенные (ТС-) клетки. Долю погибших клеток выражали в процентах от общего числа лейкоцитов в пробе.

Развитие апоптоза оценивали по накоплению активированной каспазы-3, детектируемой методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы «Quantikine Human active caspase-3», (R&D systems, США), а также по содержанию в лизатах клеток гистон-ассоциированных ДНК фрагментов (моно- и олигонуклеотидов) с использованием тест-системы для иммуноферментного анализа «Cell Death Detection ELISA» («Roche Diagnostics», США). В последнем случае рассчитывали фактор адсорбции А405, как отношение поглощения в опытной пробы к контролю.

Развитие некроза оценивали в кинетическом режиме по изменению активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в супернатантах культур лейкоцитов с использованием набора «ЛДГ-УФ-Ново» («Вектор-Бест», Россия). Присутствие ЛДГ в пробе выражали в единицах активности (Е/л).

Мембранолитическую активность ГСЛ и АОБ оценивали в тесте осмотической резистентности эритроцитов по выходу гемоглобина, определяемого спектрофотометрически (>.=620 нм). Исходя из полученных данных, рассчитывали величину пятидесятипроцентного лизиса эритроцитов Х50.

Спонтанную и индуцированную внесением в реакционную смесь клеток S. aureus FDA 209Р дегрануляцию лейкоцитов, оценивали на 5 и 30 мин контакта. Присутствие лактоферрина исследовали методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы «Лактоферрин - стрип» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), выражая его величиной нг/мл. В свою очередь активность лизоцима тестировали в кинетическом режиме с использованием оригинальной методики оценки активности бактериолитических ферментов (патент РФ на изобретение № 2410436), по способности вызывать лизис культуры М. Intens АТСС 15307. Активность фермента

выражали количеством бактериальных клеток, разрушающихся в 1 мл реакционной смеси в единицу времени (кл/млс). На основе нолученных данных рассчитывали относительный показатель интенсивности экзоцитоза.

Поглотительную активность лейкоцитов оценивали с использованием ФИТЦ-мсченных клеток S. aureus Cowan I на проточном цитофлюориметре BD FACS Calibur («Becton Dickinson», США). Гейтирование осуществляли по параметрам светорассеяния. Разделение популяции лейкоцитов на поглотившие и не поглотившие S. aureus Cowan I вели по интенсивности зеленой флюоресценции.

Влияние ГСЛ и АОБ на окислительный метаболизм нейтрофильных лейкоцитов при фагоцитозе определяли в тесте активированной люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) с использованием двухканального биохемилюминометра БЛМ8802М2К (СКТБ «Наука», Россия). Фагоцитарную реакцию запускали внесением в пробы взвесей S. aureus FDA 209Р. Фиксировали спонтанную и индуцированную ЛЗХЛ.

Влияние ГСЛ и АОБ на окислительные процессы изучали по интенсивности свечения модельной ферментной системы, содержащей раствор ауторегулятора, пероксидазу хрена (Sigma-Aldrich, США), Н2О2, люминол (Sigma-Aldrich, США) и натрий-фосфатный буфер pH 8.6. На основании полученных данных проводили расчет относительного индекса хемилюминесценции (ИХЛ).

Спонтанную и индуцированную липополисахаридом Е. coli 055:В6 (Sigma-Aldrich, США) продукцию цитокинов оценивали по содержанию в супернатантах клеточных культур интерлейкина-lß (ИЛ-lß), интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) методом иммуноферментного анализа с использованием наборов «ИЛ-ИФА-БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия). Полученный результат выражали величиной пг/мл.

Статистическая обработка проводилась на базе компьютерной программы «Statistica 6.0». Для оценки отдельных механизмов действия ГСЛ и АОБ использованы процедуры корреляционного, одно- и многофакторного дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первым экспериментально зафиксированным проявлением активности ГСЛ и АОБ в отношении лейкоцитов периферической крови человека явился цитотоксический эффект, оцененный с использованием метода селективной окраски мертвых клеток красителем трипановым синим. Подсчет окрашенных (ТС+)

гранулоцитов показал, что контакт с ГСЛ и АОБ в наибольшей из использованных концентраций 10"4 М сопровождался появлением большого количества погибших клеток. В частности, воздействие отдельных гомологов ГСЛ приводило к гибели от 72.81±3.1% (Р<0.01) до 96.13±4.99% (Р<0.001) обработанных ими гранулоцитов. Сходный результат отмечен и в группе АОБ, различные гомологи которых в концентрации 10"4 М обусловливали появление от 68.6±1.8% (Р<0.05) до 95.90±4.98% (Р<0.001) (ТС+) клеток. В то же время снижение действующих концентраций ГСЛ и АОБ до 10"6 М сопровождалось резкой утратой цитотоксичности, на статистически значимом уровне сохраняющейся при использовании в этой концентрации только длинноцепочечного гомолога С12-ГСЛ (34.00±1.84%; Р<0.01).

Более устойчивыми к действию ГСЛ и АОБ оказались моноциты. Токсичность ГСЛ и АОБ была статистически достоверна только после их предварительной инкубации с длинноцепочечными С,2-ГСЛ и С12-АОБ в концентрации 10"5, 10"4 М. Процент погибших (ТС+) клеток после контакта с С,2-ГСЛ составил до 14.80±0.91% (р<0.05), тогда как при внесении в систему С,2-АОБ содержание (ТС+) моноцитов варьировало в пределах 9.8±0.55% и 10.9±0.61% (р < 0.05).

С целью более детального анализа описанных эффектов было проведено исследование природы выявленной цитотоксичности ГСЛ и АОБ с помощью обнаружения специфических маркеров апоптоза и некроза на примере наиболее активных длинноцепочечных гомологов внутри каждой группы ауторегуляторов (таблица 1). Количественная оценка динамики образования активированной каспазы-3 позволила зафиксировать появление этого ключевого эффекторного фермента системы апоптоза в экстрактах гранулоцитов, предварительно обработанных С12-ГСЛ. Прединкубация с С12-ГСЛ в концентрации 10"6, 10'5 и 10"4М в течение 1 часа вызывала дозозависимое накопление активированной каспазы-3 до 101.27±10.34 нг/мл, а прединкубация гранулоцитов втечение 4 часов-4-12-кратное увеличение содержания данного фермента. Клетки моноцитов оказались менее чувствительны к действию С(2-ГСЛ. Предварительная обработка этим ауторегулятором в концентрации 10"5 и 10"4 М увеличивала содержание в их лизатах активированной каспазы-3 до 6.95±0.39 нг/мл и 10.25±0.58 нг/мл (р<0.01) после 1часа контакта и до 9.05±0.53 нг/мл и 12.05±0.75 нг/мл (р<0.01) после 4 часов контакта, соответственно. В тех же условиях проведения эксперимента Сп-АОБ не показал статистически-значимой активности.

Таблица 1 - Эффекты С12-ГСЛ и Сц-АОБ на характеристики жизнеспособности гранулоцитов (Г) и моноцитов (М)

Ауто-регулятор Концентрация, М (ТС+) погибшие клетки,% Концентрация активной каспазы-3, нМ Фактор адсорбции, А405 ЛДГ активность, Е/л

Г М Г М Г М Г М

Контроль 0 1.40 (0.80) 2.20 (0.13) 0.12 (001) 1.18 (0.12) 1.00 (0. 10) 1.00 (0.09) 701.87 749.73 (35.34) (41.31)

ю-7 10'6 ю-5 ю-4 5.00 6.20 0.09 1.03 0.87 1.05 712.97 811.46

(0.30) 34.00** (0.39) 8.00 (0.01) 8.60** (0.06) 1.04 (0.04) 1.40 (0.06) 1.07 (37.07) (47.06) 717.24 811.46

Сц-ГСЛ (1.84) 92.10*** (0.45) 10.60* (0.36) 27.26** (0.06) 6.95** (0.09) 2.43* (0.05) 1.36 (32.28) (46.25) 713.38 818.27

(4.88) 96.13*** (0.51) 14.80* (5.34) 101.27*** (0.39) 10.25** (0.13) 7.03** (0.11) 1.62* (39.95) (45.00) 726.59 830.95

(4.99) (0.91) (10.34) (0.58) (0.42) (0.09) (36.33) (44.04)

ю-7 10'6 ю-5 ю-4 6.70 0.01 0.13 0.77 1.05 0.92 694.36 787.24

(0.41) 8.50 (0.001) 6.80 (0.01) 0.09 (0.05) 0.79 (0.06) 0.98 (0.05) 1.01 (37.00) (43.74) 880.59* 799.86

С12-АОБ (0.46) 68.60** (0.42) 9.80 (0.01) 0.13 (0.04) 0.85 (0.05) 1.00 (0.05) 0.84 (46.67) (36.79) 1041.29**944.68*

(3.49) 95.90*** (0.55) 10.90* (0.01) 0.16 (0.06) 0.89 (0.06) 1.04 (0.05) 0.86 (62.48) (57.63) 1205.16**959.83*

(4.98) (0.61) (0.02) (0.06) (0.06) (0.04) (65.08) (52.79)

Примечание: (стандартные ошибки); * Р<0.05; ** Р<0.01; *** Р<0.001 по отношению к контролю.

Другим проявлением апоптоза, характеризующим наиболее поздние стадии этого процесса, является двухцепочечное, межнуклеосомное расщепление ДНК до фрагментов моно- и олигонуклеотидов регулярного размера. Измерение содержания таких гистон-ассоциированных фрагментов, показало, что обработка лейкоцитов С12-ГСЛ приводила к расщеплению ДНК уже через 1 час контакта с ауторегулятором. Достоверно отличающиеся от контроля значения фактора адсорбции Aio5 достигались после обработки гранулоцитов С12-ГСЛ в концентрации 10'5 и 10"4 М и составляли соответственно 2.43±0.12 (р<0.05) и 7.03±0.42 отн. ед. (р<0.01). Инкубация гранулоцитов с С^-ГСЛ в течение 4 часов приводила к более интенсивной фрагментации ДНК со значениями А405 от 6.74±0.35 отн. ед. до 9.16±0.53 (р<0.01). Аналогичные по направленности, но количественно менее выраженные тенденции наблюдались при анализе эффектов Сп-ГСЛ на моноциты (таблица 1).

В целом, полученные результаты показали, что обработка лейкоцитов С12-ГСЛ приводила к их гибели по пути апоптоза. Однако, после контакта лейкоцитов с С12-АОБ маркеры апоптоза не обнаруживались.

Для исследования иного механизма гибели лейкоцитов изучено высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - цитоплазматического фермента эукариотических клеток, поступление которого в культуральную среду является следствием деструкции клеточной мембраны и характерного для некроза лизиса клеток. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствие значимых и достоверных различий между высвобождением ЛДГ у обработанных С^-ГСЛ клеток и контролем. С другой стороны, значительное увеличение активности фермента было продемонстрировано в клеточных супернатантах после предварительной инкубации с С12-АОБ. Высвобождение ЛДГ после контакта с С,2-АОБ (10"6, 10"5, 10"4 М) было несколько выше у гранулоцитов (880.59±46.67, 1041.29±62.48 и 1205.08±65.08 Е/л; р<0.01), чем у моноцитов (799.86±36.79, 944.68±57.63 и 959.83±52.79 Е/л; Р<0.01).

С целью уточнения механизма цитотоксического действия было изучено влияние ГСЛ и АО Б на стабильность мембран клеток на модели осмотической резистентности эритроцитов. При этом, изучали процессы лизиса эритроцитов, предварительно инкубированных с С12-АОБ и С,2-ГСЛ при 37°С в течение 1 часа. Различия между сигмовидными кривыми осмотической резистентности оказались значимыми для клеток обработанных С12-АОБ в концентрации 5" 10"5 М и выше. Установлено, что показатели пятидесятипроцентного лизиса клеток эритроцитов (Х50) в контрольных пробах с интактными эритроцитами составляли 0.46 ± 0.03 г/дл ЫаС1. После контакта с С12-АОБ в концентрации 10"4 М значение Х50 увеличивалось до 0.78±0.04 г/дл №С1 (р<0.01), что свидетельствовало о способности С,2-АОБ дестабилизировать мембраны эритроцитов, тем самым меняя их проницаемость и выход гемоглобина во внеклеточное пространство.

Резюмируя полученные данные, можно отметить, что при общем проявлении цитотоксических эффектов в миллимолярных дозах, механизмы повреждающего воздействия отличались у разных классов ауторегуляторов: ГСЛ направляли гибель клеток по пути апоптоза, тогда как цитотоксичность АОБ ассоциировалась со способностью вызывать быстрый лизис лейкоцитов (некроз) через повреждение клеточных мембран.

На следующем этапе работы была дана оценка эффектов субцитотоксических концентраций ГСЛ и АОБ на некоторые функциональные характеристики лейкоцитов. В частности, было изучено влияние химических аналогов бактериальных ауторегуляторов на секреторную и поглотительную функции нейтрофильных лейкоцитов периферической крови человека. При этом, проведенные исследования позволили описать комплексный эффект

ауторегуляторных факторов, с одной стороны зависящий от активации клеток (в отсутствие запуска фагоцитарной реакции эффекты ГСЛ и АОБ были выражены слабо), а также от особенностей химического строения использованных гомологов и их действующих концентраций. С другой стороны, результативность эффекта также определялась сочетанием цитотоксического и регуляторного действия ГСЛ и АОБ.

Исследование влияния ГСЛ и АОБ на показатели секреторной дегрануляции нейтрофильных лейкоцитов позволило констатировать, что в отсутствие запуска фагоцитарной реакции при обработке клеток ауторегуляторами их активность характеризовалась стабильно низкими показателями спонтанного высвобождения лактоферрина и лизоцнма, составляющими 60.01-95.99 нг/мл и 71.10-99.41 кл/млх, что существенно не отличалось от контрольных значений, описываемых величинами 80.30±12.15 нг/мл и 86.35±10.32 кл/млх, соответственно.

В свою очередь, при индукции клеток внесением фагоцитируемого объекта было зарегестрировано как 10-13 кратное увеличение интенсивности высвобождения ферментов в контрольных пробах, так и подавление процесса экзоцитоза специфических и азурофильных гранул во всем диапазоне воздействующих концентраций ГСЛ и АОБ. Регистрируемые в данном случае исходные особенности процесса дегрануляции заключались в более интенсивном выбросе лактоферрина уже на 5-й минуте после стимуляции. Подобная активность определялась первичным характером слияния с клеточной мембраной именно специфических гранул, содержащих лактоферрин, и, в дальнейшем, возрастала слабо от 758.42±24.44 нг/мл до 842.21±38.95 нг/мл к 30-й минуте контакта. В свою очередь увеличение активности лизоцима в супернатанте было более плавным, от 809.78±15.38 кл/мл с до 1166.94±51.32 кл/млх, отражая последовательный характер экзоцитоза специфических и азурофильных гранул.

Иммуноферментный анализ присутствия лактоферрина в супернатантах фагоцитирующих нейтрофильных лейкоцитов, предварительно обработанных ГСЛ и АОБ, свидетельствовал о зависимости репрессии экзоцитоза от особенностей химического строения и действующих концентраций данных малых молекул. В частности, наибольшее подавление выброса лактоферрина было зафиксировано при воздействии длинноцепочечного С12-ГСЛ. В своей наибольшей концентрации 10"4 М этот ауторегулятор снижал интенсивность экзоцитоза до 22.33±1.10% (Р<0.01) к 5 минуте и до ЗО.ОШ.54 (Р<0.01) к 30 минуте стимуляции фагоцитоза. Влияние аналогичных концентраций С12-АОБ также характеризовалось значительным угнетением экзоцитоза и численно выражалось как 29.02±1.84% (Р<0.01) от

контрольных значений с последующим частичным восстановлением до 47.41±2.43% (Р<0.05). Эффект аналогичных концентраций С6-ГСЛ и С6-АОБ описывался величинами от 16.42±1.01% (Р<0.01) до 45.5±3.01% (Р<0.05) и от 29.2Ш.73 % (Р<0.01) до 58.34±3.10% (Р<0.05) от соответствующих контролей. При уменьшении дозы воздействия наиболее общей тенденцией было некоторое превалирование регистрируемой активности у длинноцепочечных ГСЛ и АОБ, а также дозозависимое снижение выраженности эффекта, продолжающего, однако, сохраняться ниже контрольных значений.

Анализ закономерностей выброса лизоцима нейтрофильными лейкоцитами периферической крови человека при запуске фагоцитоза свидетельствовал о репрессии секреторной дегрануляции при использовании С)2-ГСЛ и С12-АОБ в концентрации 10"4 М - 36.51±2.1% (Р<0.05) и 28.62±1.73% (Р<0.01) на 5-й минуте контакта; 35.51±2.10% (Р<0.05) и 29.84±1.33% (Р<0.01) на 30-й минуте контакта с последующим дозозависимым снижением выраженности эффекта. Уменьшение длины углеводородного радикала в молекулах ГСЛ и АОБ село к снижению способности изменять интенсивность дегрануляции. В свою очередь, определенной особенностью экзоцитоза лизоцима являлась его в 1.2-1.9 раза меньшая, чем у лактоферрина, зависимость от влияния ауторегуляторов, что предположительно могло быть следствием большей устойчивости к подобному воздействию азурофильных гранул. Тем не менее, во всей анализируемой выборке показатели экзоцитоза лактоферрина и лизоцима положительно коррелировали друг с другом (1=0.781; Р<0.01 для ГСЛ и г=0.863; Р<0.01 для АОБ), что характеризовало зафиксированные с их использованием изменения интенсивности секреторной дегрануляции как взаимосвязанные проявления биологической активности ГСЛ и АОБ.

В следующей серии экспериментов было проанализировано влияние АОБ на поглотительную способность нейтрофильных лейкоцитов. Анализ гистограмм светорассеяния и флюоресценции гейтированных кластеров свидетельствовал, что поглотительная активность нейтрофильных лейкоцитов, сохранивших свою жизнеспособность после обработки длинноцепочечными гомологами АОБ в концентрации 10"4 М оказалась существенно репрессированной. При этом, фиксировалось как 2-4 кратное снижение доли фагоцитирующих клеток (до 42.47 и 19.52 %, соответственно, против 78.89 % в контроле), так и поглотительной активности отдельных клеток. В частности, зарегистрированные значения флуоресценции, коррелирующие с количеством бактерий, захваченных одним

нейтрофилом. снижались с референтных значений 716.79 усл. ел. до 265.56 и 132.86 усл. ед. при воздействии С»- АОБ и Си-АОБ. соответственно. Па -пом фоне уменьшение концентрации действующих факторов сохраняло их регулаториые зффекты, среди которых наиболее стабильным окат л ос. уменьшение количества бактериальных клеток, фагоцитированных одним нейтрофилом.

Па основании полученных результатов было рассчитано соотношение эффектов ЛОБ на погжтгтельную и секреторную функции нейтрофильных лейкоцитов (рисунок 2).

Рисунок 2 соотношения между обусловленной нимействисм АОВ рсирсссиеТ псилогетслыюй функции нейтрофильных лейкоцитов и подавлением ткдацнття Примечание: Показатели жюиитота лактоферрика (левая шкала. светлые круги), яиоцича травм шкала, темные круга)

Наиболее важным результатом проведенного аналита явилось выявление статистически значимой зависимости, связывающей количество захваченных одним нейтрофилом бактерий и количество выделенного в процессе чкзоцитоза лактоферрииа (г=0.701; Р<0.05) или люоцима (г-0.914; Р<0.01). Таким образом, интегральным эффектом АОЬ в отношении анализируемых показателей активации нейтрофнлов при фагоцитозе оказалось сочетай нос подавление как чндо-, так и экзоцитоза.

На следующем зтапе работы было изучено влияние ГСП и АОВ на интенсивность люминолзавнеимой хсмилюминссценции (ЛЗХЛ) нейтрофильных .зейконитов периферической крови человека. наиболее показательно характеризующей активацию кислород-зависимых бактерицидных систем при фагоцитозе.

Величины спонтанного (неиидуцированною) свечения суспензии нейтрофильных лейкоцитов свидетельствовали о низком уровне клеточной активности и характеризовались усредненными показателем ЛЗХЛ I02.94i8.24 отн. ед. При згшм, ни в одном из вариантов внесения ГСЛ и АОБ не было выявлено достоверных отличий свечения в контрольных и опытных пробах, показатели ЛЗХЛ которых варьировали в пределах 94.01-111.18 отн. ед.