научная статья по теме ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ “ГИСТОН-АНТИГИСТОН” В СООБЩЕСТВЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI И ИНФУЗОРИЙ TETRAHYMENA PYRIFORMIS Биология

Текст научной статьи на тему «ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ “ГИСТОН-АНТИГИСТОН” В СООБЩЕСТВЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI И ИНФУЗОРИЙ TETRAHYMENA PYRIFORMIS»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 2, с. 219-225

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ "ГИСТОН-АНТИГИСТОН" В СООБЩЕСТВЕ

БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI И ИНФУЗОРИЙ TETRAHYMENA PYRIFORMIS

*Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург **Оренбургская государственная медицинская академия МЗ РФ Поступила в редакцию 28.12.2006 г.

На модельной системе "Escherichia coli-Tetrahymena pyriformis" экспериментально установлено участие антигистоновой активности бактерий и гистонов простейших во взаимодействиях про- и эукари-отических микроорганизмов. E. coli с антигистоновой активностью лучше сохранялись в сообществе с T. pyriformis, о чем свидетельствовала динамика численности бактерий. Штамм с антигистоновой активностью индуцировал незавершенный фагоцитоз у инфузорий, что проявлялось изменением цитологических показателей и ультраструктурными признаками сохранения бактериальных клеток в фа-госомах. Бактерии с антигистоновой активностью, локализованные в цитоплазме T. pyriformis, воздействовали на эукариотическое ядро, что сопровождалось декомпактизацией макронуклеуса и снижением среднего показателя содержания гистонов в популяции инфузорий. Полученные данные позволяют рассматривать инактивацию гистонов простейших бактериями в качестве одного из механизмов персистенции прокариот в сообществах с эукариотическими микроорганизмами.

Ключевые слова: простейшие, бактерии, гистоны, персистенция, Escherichia coli, Tetrahymena pyriformis.

В экологии микроорганизмов одним из наименее изученных вопросов является участие клеточных метаболитов в функционировании микробных сообществ. Во взаимодействиях про- и эукариотических микроорганизмов интерес представляют катионные белки и пептиды (лизоцимы, гистоны, дефенсины, амебопоры и др.) в силу своей биологической универсальности и антибактериальной активности [1]. Среди катионных белков важное место занимают гистоны, имеющие внутриядерную локализацию и формирующие уникальную связь с ДНК в процессе ее упаковки в хромосомы [2].

На современном этапе исследований гистонов установлены структура и основные функции этих белков [3]; обнаружены гистоноподобные белки прокариот [4], схожие по структуре с гистонами; расшифрованы механизмы пространственного взаимодействия гистонов с ДНК [5]; установлено участие этих белков в реализации наследственной информации путем регуляции транскрипции [6]; выявлено их антибактериальное действие [7]. Установлено, что гистоны, выделяемые в очаге воспаления разрушенными лейкоцитами, за счет своего антибактериального эффекта могут способствовать элиминации возбудителя [8]. Выявлена способность бактерий к инактивации антибактериального эффекта гистонов, названная ан-

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: protoz@mail.ru).

тигистоновой активностью [9]. Предложена модель "E. coli-T. pyriformis" для оценки участия катионных белков и их ингибиторов в межмикробных взаимодействиях [10].

Несмотря на достигнутые успехи в области изучения гистонов, их роль во взаимодействиях про-кариотических и эукариотических микроорганизмов остается неизученной. Цель работы заключалась в экспериментальной оценке взаимодействий "гистоны простейших-антигистоновая активность бактерий" на модельном сообществе микроорганизмов E. coli и T. pyriformis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования использовали аксеническую культуру инфузорий Tetrahymena pyriformis GL, любезно предоставленную д.б.н. В.И. Пушкаревой (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). В работе применяли изогенные клоны бактерий Escherichia coli, полученные методом отпечатков [11]. Клон E. coli (АГА+) проявлял антигистоновую активность (АГА) на уровне 8.2 мкг/мл, клон (АГА-) не обладал этим свойством. Антигистоновую активность бактерий определяли методом фотометрической регистрации степени задержки роста индикаторного штамма Micrococcus luteus (№ 2665 ГНИСК

14 13 12 11 10 9

Рис. 1. Численность бактерий в чистой культуре (1,2) и в сообществе с T. pyriformis (3, 4). 1, 3 - E. coli (АГА+), 2, 4 - E. coli (АГА-).

им. Л.А. Тарасевича) после его инкубации с супер-натантом исследуемой культуры и гистонами [12].

Для сокультивирования E. coli выращивали в течение суток на мясо-пептонном агаре, а инфузории в течение трех суток на среде оригинального состава, содержащей мясо-пептонный бульон, автолизат пекарских дрожжей и лошадиную сыворотку. Из культур бактерий готовили взвесь на стерильном 0.9% растворе NaCl по оптическому стандарту мутности 10 Ед (109 КОЕ/мл). Простейшие отмывали от среды культивирования трехкратным центрифугированием в течение 10 мин с заменой среды.

Сокультивирование T. pyriformis с E. coli проводили в пробирках с питательной средой для простейших. В каждую пробирку со средой объемом 5 мл вносили культуру инфузорий и взвесь бактерий до создания конечных концентраций 105 и 108 кл/мл соответственно. Пробирки инкубировали при температуре 25°С. В опытных пробирках осуществляли сокультивирование T. pyriformis с культурами E. coli, различающимися по антигистоновой активности. В качестве контроля наблюдали чистые культуры инфузорий и бактерий в питательной среде для простейших.

Во время сокультивирования контролировали численность E. coli путем рассева шпателем 0.1 мл серийных 10-кратных разведений на мясо-пептонный агар. Подсчет клеток T. pyriformis осуществляли в камере Горяева.

Интенсивность фагоцитоза бактерий простейшими оценивали по индексу Гамбургера (доля фа-гоцитарноактивных клеток, содержащих фагосо-мы с бактериями, в %) и индексу Райта (среднее число фагосом в одной инфузории), которые определяли по модифицированной методике Пушкаре-вой [13]. Для этого из осадка, полученного при центрифугировании культур, готовили мазки, вы-

сушивали их на воздухе, фиксировали в жидкости Лилли (смесь ледяной уксусной кислоты и 96% этилового спирта в соотношении 1 : 2), окрашивали синькой Мансона и микроскопировали под увеличением х1000.

Содержание гистонов в клетках инфузорий оценивали цитохимическим методом Олферта-Ге-швинда в модификации Эренпрейса [14] с использованием красителя амидо черного 10Б. Оценку цитохимической реакции на гистоны производили визуально по интенсивности окраски ядер в баллах: отсутствие окраски - 0, незначительное синее окрашивание - 1 балл, интенсивное синее окрашивание - 2 балла, выраженное темно-синее окрашивание - 3 балла. Содержание гистонов в популяции инфузорий выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) [15], который рассчитывали по формуле на основании оценки 100 клеток в мазке:

3 х a + 2 х b + c 1Ö0 '

где a, b, c - число клеток с соответствующей интенсивностью окраски ядер, от 3 до 1.

Ультраструктурные изменения простейших T. pyriformis, взаимодействующих с E. coli, регистрировали электронно-микроскопически через 1, 3, 6, 18 и 24 ч от начала сокультивирования. Для этого осадки, полученные при центрифугировании исследуемых культур, фиксировали 4% глютаровым альдегидом (60 мин), затем 1% тетраоксидом осмия (60 мин). Осадки обезвоживали в растворах ацетона восходящей концентрации (30, 50 и 100%) и заливали в эпон-812. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-5, подвергали двойному контрастированию растворами уранилацетата и цитрата свинца. Исследование ультратонких срезов и их выборочное фотографирование проводили в электронном микроскопе ЭМВ-100 АК.

Популяционная динамика численности микроорганизмов

Чистые культуры E. coli (АГА+ и АГА-) в контроле увеличивали свою численность в соответствии с физиологической кривой роста бактериальной популяции в жидкой среде (рис. 1). В течение 2 сут от начала эксперимента наблюдали логарифмическое увеличение количества жизнеспособных клеток, почти на пять порядков, после чего наступала стационарная фаза со стабилизацией численности бактерий.

Для бактерий, взаимодействующих с инфузориями, была характерна иная популяционная динамика. В результате активного выедания простейшими существенного увеличения численности E. coli (АГА-) при сокультивировании не наблюдали, и

ВЗАИМОДЕИСТВИЯ "ГИСТОН-АНТИГИСТОН" В СООБЩЕСТВЕ БАКТЕРИИ

Изменения среднего цитохимического коэффициента и гетерогенности популяции Т. pyriformis по содержанию гистонов

Контрольная популяция Опытная популяция, сокультивированная с E. coli (АГА+)

0 ч 6 ч 18 ч 24 ч

Средний цитохимический коэффициент (усл. ед.) Высокое (3 балла) Среднее (2 балла) Низкое (1 балл) Отсутствие (0 баллов) 2.92 ± 0.19 Доля клеток с ра 92 8 0 0 2.92 ± 0.19 1зличным содерж 92 8 0 0 2.78 ± 0.18 санием гистонов, 78 22 0 0 2.20 ± 0.16 (%) 32 56 12 0 1.36 ± 0.14 12 25 50 13

кривая роста имела незначительные колебания (рис. 1). Так, через сутки концентрация E. coli (АГА-) выросла примерно в 5 раз, по сравнению с началом опыта, и составила 0.72 ± 0.08 х 109 КОЕ/мл. В дальнейшем численность бактерий существенно не менялась и находилась на уровне 108-109 КОЕ/мл до конца эксперимента.

В опытных пробирках, содержащих T. pyriformis и E. coli (АГА+), наблюдали выраженный рост численности бактерий, который, однако, не достигал контрольных значений чистой культуры E. coli (рис. 1). Так, если в начале опыта концентрация бактерий составила 0.16 ± 0.03 х 109 КОЕ/мл, то уже через сутки она возросла почти в 30 раз, а на третьи сутки - почти на 3 порядка, достигнув количества 129.60 ± 6.5 х 109 КОЕ/мл. После этого концентрация E. coli (АГА+) стабилизировалась вплоть до конца наблюдения на уровне 1010-1011 КОЕ/мл. Описанная динамика численности бактерий в сообществе с T. pyriformis свидетельствует об интенсивном выедании E. coli (АГА-) простейшими и большей резистентности E. coli (АГА+) к фагоцитозу.

Динамика численности инфузорий, взаимодействующих с бактериями, не сопровождалась резкими колебаниями, которые могли быть обусловлены цитотоксическим эффектом со стороны бактерий. Численность T. pyriformis в опытных пробирках, сокультивированных с E. coli (АГА+), изменялась в пределах ф

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎