Действие сапонинов в сверхмалых дозах на некоторые физико-химические свойства их растворителя и на физико-химическое состояние мембран эритроцитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Работа выполнена на кафедре химии Курского государственного технического университета.

доктор химических наук, профессор Ниязи Фарух Фатехович

заслуженный деятель науки РФ, доктор химических наук, профессор Маркович Юрий Дмитриевич

кандидат химических наук, старший преподаватель Оксененко Ольга Ивановна

Институт Биохимической Физики им Эмануэля

Защита состоится октября 2007 г в часов на заседании

диссертационного совета К212 105.02 при Курском государственном техническом университете по адресу. 305040, г Курск, ул 50 лет Октября, 94.

Отзывы на автореферат просим присылать в двух экземплярах по адресу: 305040, г. Курск, ул 50 лет Октября, 94, на имя ученого секретаря диссертационного совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курского государственного технического университета

Автореферат разослан сентября 2007 г.

Ученый секретарь 1

Диссертационного совета К212.105.02 Кудрявцева Т Н.

Общая характеристика работы

Актуальность темы В последнее время вопросу изучения эффектов сверхмалых доз химических соединений уделяется все больше внимания.

На сегодняшний день отсутствуют простые и надежные методы отбора веществ, обладающих активностью в сверхмалых концентрациях, а так же нет единого мнения, каким образом химическое вещество в этих сверхнизких концентрациях может проявлять свои свойства. Такими веществами могут быть ферменты, биодобавки, лекарственные вещества и другие биологически активные вещества. В сверхмалых дозах вышеперечисленные вещества проявляют большой положительный эффект. Причем, никаких побочных эффектов при их применении не отмечено.

В научной литературе имеется большой банк данных по исследованию химических веществ, которые обладают эффектом сверхмалых доз. На основе этих фактов выдвинуто много теорий механизма действия сверхмалых доз химических соединений, в большинстве из них превалируют гипотезы об определяющей роли воды в этих высокоразбавленных растворах

В настоящее время отсутствует единая теория, поясняющая вопросы поднятой проблемы, мало точных научных объяснений действия СМД, а так же обоснованности связи установленных эффектов со свойствами воды в которой растворено действующее вещество

Перспективы решения этой проблемы довольно широки Изучение механизма действия сверхмалых доз и роли воды в нём, возможно, позволит создать новый класс лекарственных препаратов, которые будут иметь достаточно большой фармокологический эффект и не будут иметь побочных эффектов, что очень перспективно, например, в онкологии Уже создано несколько лекарственных препаратов на основе действия сверхмалых доз, которые запатентованы и разрешены к применению и продаже

Решение проблемы сверхмалых доз может повлиять на решение экологических проблем и пересмотр предельно допустимых концентраций, в токсикологии, так как известно, что токсические вещества при действии в сочетании со сверхмалыми дозами могут по-разному влиять на живой организм

Вопросам изучения эффектов сверхмалых доз посвящена настоящая работа, что подтверждает её актуальность и современность.

Цель работы Выявить влияние сверхмалых доз некоторых химических веществ на изменения отдельных физико-химических свойств воды, которая является их растворителем Установить воздействие сверхмалых доз гемолизирующего раствора сапонинов на изменение физико-химических свойств мембран эритроцитов.

Для достижения этой были цели решены следующие задачи: - найдено вещество, сапонин, проявляющее эффект сверхмалых доз, установлен эффект сверхмалых доз сапонина на биомодели - эритроцитах крови;

- установлено изменение высоты мениска в капилляре для проб сверхмалых доз раствора сапонинов,

- проведено исследование влияния температурного режима на изменение высоты мениска в капилляре для проб сверхмалых доз раствора сапонинов,

- исследовано влияние постоянного магнитного поля на изменение высоты мениска в капилляре для проб сверхмалых доз раствора сапонинов,

- установлено изменение электропроводности водных растворов сапонинов в зависимости от их разведения;

- выявлены некоторые изменения ИК-спектров воды для некоторых высокоразбавленных растворов сапонинов,

- методом ЭПР-спектроскопии проведено исследование изменения микровязкости липидного бислоя мембран эритроцитов под действием сверхмалых доз раствора сапонинов

Научная новизна исследования и положения выносимые на защиту:

- Установлен эффект сверхмалых доз для раствора сапонинов

- Показано, что разведения раствора сапонинов, дающие при исследовании снижения высоты мениска в капилляре, обладают эффектом сверхмалых доз

- Показана связь, между действием сверхмалых доз раствора сапонинов и изменением определенных физико-химических свойств воды, являющейся растворителем сапонинов.

Научно-практическая значимость. Определен простой, надежный метод капиллярного анализа отбора веществ, обладающих активностью в сверхмалых дозах, дающий возможность указания, при каких разведениях возникает этот эффект.

Выявлена возможность применения эффекта торможения гемолиза сверхмалыми дозами гемолизирующего раствора в нейтрализации гемолитического яда.

Настоящие исследование сделает информационный вклад в изучение проблемы сверхмалых доз

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждались на конференциях "Молодежная наука и современность" (Часть П КГМУ Курск 2006 г), "Материалы международной юбилейной научно-практической конференции поев 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России" (Курск 2006 г), на информационном семинаре "Перспективы расширения участия ВУЗов и научных организаций в Шестой/Седьмой рамочных программах ЕС по научно-технологическому развитию" (Воронеж, 2006 г )

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, в том числе одна в рецензируемом > журнале, подана заявка на патент

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка литературы из 125 наименований, приложения, и содержит 123 страницы, 35 рисунков, 10 таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении к диссертации обосновывается актуальность темы, определяются цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы

В первой главе приводится литературный обзор проблемы сверхмалых доз, описываются эффекты, закономерности и концентрационные интервалы возможной активности сверхмалых доз различных химических веществ. Представляются разные гипотезы механизмов действия сверхмалых доз различных веществ. Наибольшее внимание уделено гипотезам о роли воды в механизме действия сверхмалых доз, которые сводятся к тому, что вещество в определенных сверхмалых дозах может влиять на воду, изменяя её некоторые физико-химические свойства Рассматриваются результаты современных физико-химических исследований о структуре и свойствах воды. Приведены области и перспективы применения сверхмалых доз различных веществ.

Вторая глава посвящена установлению факта действия сверхмалых доз для некоторых веществ.

Из литературных источников известно, что, в основном, эффектом сверхмалых доз обладают вещества биологически-активные, поэтому для исследований был выбран гемолизирующий раствор сапонинов и соответствующий объект воздействия - эритроциты донорской крови.

Был установлен факт активности раствора сапонинов в областях степеней разведения 10'8 - 10"12 и 10"20-Ю"24 от исходной действующей концентрации (исходная действующая концентрация определялась экспериментально, и составила 0,0113 г действующего вещества на начальное разведение) Известно, что эритроциты растворяются при действии на них гемолизирующего раствора сапонинов. Было установлено, что при добавлении сверхмалых доз этого же раствора сапонинов (в областях

степеней разведения 10 ° - 10'" и 10" -10" от исходной концентрации) к эритроцитам, гемолиза практически не наблюдается, при добавлении стандартной действующей концентрации этого раствора. Данное явление было обнаружено при исследовании влияния на эритроциты широкого диапазона разведений (от 10"2 до 10"28 степени разведения от исходной действующей концентрации) раствора сапонинов. Так как эффект торможения гемолиза наблюдался визуально по окраске надосадочной жидкости, то для более точного определения наличия эффекта сверхмалых доз каждую пробирку исследовали на оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Рис 1. На рисунке 1 показано снижение оптической плотности для образцов эритроцитов № 5 и №11, на

которые предварительно воздействовали помимо стандартной дозы гемолизирующего раствора, растворами сапонинов в степенях разведения Ю"[0 и 10"'2 соответственно.

Помимо стандартного раствора сапонинов исследовались другие вещества, в тех же степенях разведения, на предмет возникновения "эффекта сверхмалых доз".

Такими веществами являлись уксусная кислота (СН3СООН) и нитрит натрия (ЫаМСЬ). Названные вещества в обычных концентрациях обладают гемолитической активностью. Но при исследовании этих веществ в интервалах разведений 1(Р - 10"28 степени от исходной пороговой концентрации не было обнаружено никакой закономерности соответствующей эффектам сверхмалых доз. Однако, это не означаем что эти вещества не могут обладать вышеназванным эффектом, так как возможно, эффект сверхмалых доз для этих веществ проявляется в более низких, еще не изученных концентрациях или при других условиях.

4 б е ю 12 14 16 ia го гг 24 гв 28 -ig степень разведения

0.9 0,8 0.7 0.6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 а

Рис.) Зависимость оптической плотности надосадочной жидкости эритроцитов, от влиянии на них различных разведений стандартного раствора сапонинов

Выявлена гипо г ликемичес кая активность инсулина в разведениях 10"1S От действующей концентрации, Гипогликемический эффект сверхмалых доз инсулина установлен у животных in vivo на модели аллоксаиового диабета. Однако остаются неясными вопросы о надежной воспроизводимости эффекта, зависимости действия от индивидуальной чувствительности подопытных животных, возможной модуляции действия другими препаратами и приложимости феномена бипатии.

Вследствие этого, дальнейшие исследования проводились с разведениями раствора сапонинов, при работе с которыми, были получены наиболее четкие и воспроизводимые результаты.

В третьей главе проводится исследование изменения некоторых физико-химических свойств воды, которая являлась растворителем для соответствующих разведений сапонинов.

Образцы четырнадцати разведений раствора сапонинов (от 10" до 1СГЕ степени разведения от исходной действующей концентрации) катетометр и чески исследовались на изменение высоты мениска в капилляре при постоянной температуре 25°С. Результатом явилось то, что высота мениска В капилляре понижалась только в двух образцах №6 и №11, что соответствует разведениям гемолизирующего раствора 10"12 и 10"2г от исходной концентрации. Снижение высоты мениска в капилляре для указанных разведений отмечено в среднем на 32,4%, относительно контроля, относительно остальных проб разведений в среднем на 20,5%.Снижение высоты мениска в капилляре говорит об уменьшения краевого угла смачивании, так как в капиллярах косинус этого угла прямо пропорционален высоте мениска жидкости, а следовательно, об уменьшении поверхности мениска, это в свою очередь свидетельствует об увеличении поверхностного натяжения. В других пробах разведений изменения высоты мениска в капилляре не значительное. Такая закономерность отражена на рисунке 2.

Известно, что форма и размеры растворенных частиц оказывают влияние на ближайшее окружение растворителя, а так же на их ориентационное взаимодействие с окружающими молекулами растворителя. При растворении происходит некоторое изменение структуры воды вблизи растворенных частичек, что может приводить к изменению микровязкости в ближайшем их молекулярном окружении.

г 4 6 6 10 12 14 16 13 го 22 24 26 28-4д степень разведения раствора сапонинов

Рис. 2. Изменение высоты мениска раствора сапонинов в капилляре относительно степени разведения этого раствора при 1=25 °С

При этом, согласно теории К в иста и Маршалла происходят следующие процессы: 1) взаимодействие ион-ион;

2) взаимодействие ион-растворитель,

3) изменение ионами структуры воды

Предположительно, что сапонины в определенных сверхнизких концентрациях аналогичным образом влияют на воду, в которой происходит их растворение

Процесс потенцирования или интенсивного встряхивания и перемешивания предположительно связан с перестройкой водородных связей Ведь при данном процессе воде передается механическая энергия, которая, предположительно, играет немаловажную роль в процессе разведения. Необходимо учитывать, что для изменения структуры воды совершенно не обязателен "разрыв" водородных связей, требующий большого количества энергии, достаточно гораздо меньших усилий для деформации этих связей Все это в свою очередь, возможно, связано с изменением свойств растворителя — воды Само вещество, попадая в воду в силу особенности своего строения и функциональности, а так же, имея свою собственную частоту колебаний, начинает оказывать влияние на структурные характеристики воды. Затем, при интенсивном встряхивании, вся система получает избыточную энергию, способствующую движению растворяемого вещества по всему объему растворителя, а так же механическую энергию, направленную на деформацию (или разрыв) водородных связей. Далее, при последовательном разведении - при переносе установленного объема раствора в другой объем чистого растворителя -переносится не только само разводимое вещество, но и его энергетическая составляющая. Т.е это определенный избыток энергии, колебания растворимого вещества (сапонинов), колебания воды, кроме того, вновь образованные радикалы Н4 и ОН", НэО+, образованные под влиянием сапонинов и интенсивного встряхивания Все эти факторы не могут не повлиять на состав чистого растворителя, в котором вновь растворяется эта смесь. Затем это разведение вновь подвергается встряхиванию, при этом, к уже избыточной энергии, полученной при потенцировании предыдущего разведения, добавляется новая доза энергии Далее, для последовательного разведения, опять происходит перенос вещества и энергии в новый объем растворителя, при этом количество растворяемого вещества уменьшается, энергия каждого нового разведения увеличивается, увеличивается и количество радикалов, происходят все новые и новые перестройки в сетки водородных связей Итак, в определенных степенях разведения все эти факторы суммируются, радикально меняя свойства воды (свойства полученного разведения). В нашем случае это степени разведений 10'8 до 10" 12 и Ю"20 -10"24 раствора сапонинов. В работе было установлено, что в указанных степенях разведения уменьшается высота мениска в капилляре, а следовательно, увеличивается поверхностное натяжение Как мы видим, это явление носит периодичный характер, что может объясняться тем, что накопленной энергии, ионов и различных радикалов достаточно, при определенной степени разведения (10'8 - 10 и Ю"20 -10"24 степени разведения), для перестройки водородных связей и изменения свойств воды.

Далее, для следующего повторения этих изменений необходимо продолжать аналогичный процесс разведения до возникновения следующего энергетического запаса, необходимого для перестройки водородных связей.

В этом же разделе описано влияние низких положительных температурных параметров на зависимость снижения высоты мениска в капилляре раствора сапонинов от их разведения. Для этого разведения раствора сапонинов приготовлялись на би дистиллирован ной воде с температурой не превышающей 4°С. Были получены данные аналогичные выше описанным, обнаружено снижение высоты мениска в капилляре для образцов раствора сапонинов со степенями разведения Ю"12 и \0'22 от исходной концентрации на 14,5% относительно контроля (рис.3). Однако стоит отметить, что высота измеряемых менисков в капилляре для всех разведений сапонинов была менее выражена при температуре до 4°С, нежели при температуре 25°С, Мениск бидистиллированной воды в капилляре при температуре 3 С был так же меньше мениска той же воды при температуре 25сС.

Таким образом, можно предположить, что сверхмалые дозы раствора сапонинов могут влиять на некоторые свойства воды, причем роль температуры воды, в которой растворено вещество, не значительна, так как для температуры 3°С фазовая зависимость снижения высоты мениска в капилляре аналогична зависимости снижения при температуре 25°С.

степень разведения гемолизкрующего раствора

Рис. 3 ■ Изменение высоты мениска раствора сапонинов в капилляре относительно степени разведения этого раствора при температуре 3° С

Менее выраженное снижение мениска, а так же небольшая высота мениска для всех разведений и для чистой бидистиллированной воды, вероятно, обусловлено "льдообразной" структурой воды, которой обладает вода при температуре до 4°С. При указанной температуре происходит более

плотная упаковка молекул воды, что подтверждается различными гипотезами о строении воды.

Известно, что магнитные поля могут по-разному влиять на воду, изменяя её отдельные физико-химические свойства. Образцы растворов сапонинов в степенях разведения 10"2 - 10 '25 от исходной концентрации выдерживали в течении пяти минут в постоянном магнитном поле с магнитной индукцией 130,4 мТл и напряженностью 78,95 кА/м (рис.4) Далее, эти разведения исследовали катетом етрически на изменения мениска в капилляре.

Рисунок 4, Магнитная установка с омагничиваемым разведением сапонинов.

Было установлено, что при каждом разведении раствора сапонинов происходит понижение высоты мениска, нет резких скачков снижения высоты мениска, характерных для определенных степеней разведения, как в предыдущих экспериментах, что отражено на рисунке 5.

При воздействии на разведения сапонинов магнитным полем мы не видим закономерностей описанных выше, относительно мениска, напротив, мы видим совсем другую зависимость, что говорит о том, что магнитные поля своим действием перекрывают влияние сверхмалых доз и процесса потенцирования на воду.

При этом можно предположить, что частицы воды и сапонинов держатся вместе благодаря капиллярным силам воды, захваченной в их площади соприкосновения, и силами сцепления между частицами, главным образом, которые обусловлены многочисленными водородными мостиками, созданными под действием магнитного поля. В первых разведениях концентрация сапонинов больше, чем в последующих и, предположительно, под действием магнитного поля количество водородных мосгиков, которые

образуются как между молекулами воды, так и между сапонинами и водой, так же больше, чем в остальных разведениях. С увеличением степени разведения количество частиц сапонинов уменьшается, уменьшается и разнообразие водородных связей, преобладают водородные связи типа вода-вода, Поэтому жидкость с увеличением степени разведения становится менее "рыхлой", мениск в капилляре, в подтверждение этому, уменьшается при каждом разведении, соответственно, поверхностное натяжение увеличивается.

Однако, можно предположить следующее: вода под действием определенных сверхнизких концентраций веществ структурируется определенным образом, изменяя свои отдельные физико-химические свойства. Если в этих высоко разбавленных растворах имеется наличие некоторого количества растворенного кислорода, то кислород, являясь парамагнитным веществом, под действием магнитного поля, возможно, влияет на деформацию водородных связей, структурированных сверхнизкими концентрациями раствора сапонинов.

I 1 0.77 £ „- 0,74 1 £ 0.71 § | 0.68 | § 0,65

8 0,47 щ 0,44 0,41

2 4 6 8 10 12 14 16 16 20 22 24 26 264д степень разведения гемолиз и рующе го раствора

Рис.5. Изменение высоты мениска в капилляре образцов стандартного раствора сапонинов в степенях разведения 10 2 — 10

2г под действием постоянного магнитного поля

Учитывая, что магнитные поля могут изменять влияние физико-химических факторов, мы предположили, что некоторое непостоянство в полученных результатах, возможно, связано с воздействием магнитных полей на водные системы.

В этом разделе установили, что изменяется удельная электропроводность воды, в которой растворены сверхмалые дозы раствора

сапонинов. Для этого вновь приготавливали серию последовательных разведений раствора сапонинов. Далее, при помощи кондуктометра Мулътитест КС.Л-101 измеряли удельную электропроводность для каждого разведения. В результате было обнаружено небольшое повышение электропроводности для раствора сапонинов в степенях разведения 10'8 и 1СГг2