Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему: Изучение феномена приобретенной радиорезистентности опухолевых клеток

Оглавление диссертации Тырсина, Екатерина Григорьевна :: 2002 :: Москва

Г. Обзор литературы.II

1.1. Биология радиорезистентности. клеточные и молекулярные детерминанты РР).

1.1.1. Пролиферативная активность и РР.

1.1.2. Фазы клеточного цикла и РР.

1.1.3. Индуцибельные механизмы РР - роль гена р53 и апоптоза.

1.1.4. Конститутивные механизмы РР - структурная организация генома.

1.1.5. Репарация радиоиндуцированных повреждений.

1.2. Отдаленные эффекты действия радиации.

1.2.1. Отдаленные клеточные эффекты действия радиации.

1.2.2. Молекулярные механизмы отдаленных эффектов облучения.

1.2.3. Механизмы радиоиндуцированной нестабильности генома.

1.3. Возобновление роста опухоли после облучения.

1.4. Приобретенная радиоустойчивость опухолей.

1.4.1. Экспериментальные модели приобретенной РР с использованием трансплантируемых опухолей.

1.4.2. "In vivo - in vitro" модели приобретенной РР.

1.4.3. Модели приобретенной РР in vitro.

II. Материалы и методы исследования.

II. 1. Линии клеток.

11.3. Кинетика роста клеток.

11.4. Рост клеток в полужидкой среде.

11.5. Определение плоидности клеток.

11.6. Цитологические препараты для светового и флуоресцентного микроскопирования.

11.7. Проточная цитофлуориметрия.

11.8. Восстановление клеток от радиоиндуцированных повреждений.

11.9. Прививка клеток животным.

11.10. Перевод клеток из опухолей в культуру in vitro.

II. 11. Спектрофотометрическое определение ЬЬСЬ-катаболизирующей. активности клеток.

11.12. Чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам.

И. 12.1. Оценка цитотоксического действия препаратов по колониеобразующей способности.

II. 12.2. МТТ-тест выживаемости клеток.

11.13. Определение радиоиндуцированного апоптоза.

11.14. Электрофорез ДНК.

11.15. Определение функциональной активности р53 САТ-методом.

П. 16. Определение экспрессии генов методом Нозерн-гибридизации.

П. 17. Регистрация изменения структурной организации хроматина методом аномальных временных зависимостей вязкости (АВЗВ).

II.18. Статистическая обработка полученных результатов.

III. Получение и цитоморфологическая характеристика потомков облученных клеток.

III. 1. Выделение потомков облученных клеток.

Ш.2. Морфология клеток линий ПОК-10 и ПОК-20.

Ш.З. Плоидность клеток линий ПОК.

IV. Радиочувствительность потомков облученных клеток.

IV. 1. Зависимость радиочувствительности от типа твердой подложки.

IV. 1.1. Стеклянная подложка.

IV. 1.2. Пластиковая подложка.

IV.2. Зависимость радиочувствительности от сохранности. межклеточных контактов.

IV.3. Влияние радиации на способность клеток. к независимому от субстрата росту.

V. Постлучевая репопуляция ПОК.

V.1. Кинетика роста клеток линий ДХ-ТК", ПОК-Ю и ПОК-20 после у -облучения.

V.2. Динамика цитоморфологических изменений в клеточных популяциях в первые 4 суток после облучения в дозе 10 Гр.

VI. Туморогенность клеток.

VII. Стабильность радиорезистентного фенотипа ПОК-20.

VII.1. Морфология клеток и колоний.

VH.2. Клоногенная активность.

VII.3. Пролиферативная активность.

VII.4. Кинетика роста клеток.

Vin. Чувствительность ПОК к противоопухолевым препаратам.

Выяснение механизмов возникновения высокой радиорезистентности у

IX. Распределение облученных клеток по фазам клеточного цикла.

X. Эффективность восстановления ПОК от радиоиндуцированных повреждений.

X. 1. Восстановление от ПЛП.

X.2. Восстановление от СЛП.

XI. Н202 - катаболизирующая активность.

XI.1. Разложение перекиси водорода без облучения.

XI .2. Разложение клетками перекиси водорода после у-облучения.

XII. Функциональная активность р53.

XIIIЛ. По морфологическим критериям.

XIII.2. Электрофорез ДНК.

XIV. Определение экспрессии генов.

XV. Оценка роли структурной организации хроматина в формировании радиорезистентности ПОК.

XV. 1. Исходная организация хроматина интактных клеток.

ХШ.2. Влияние облучения на изменение структуры хроматина.

XIII.3. Восстановление структуры хроматина после облучения (репарация)

Введение диссертации по теме "Онкология", Тырсина, Екатерина Григорьевна, автореферат

Проблема рецидивов, нередко возникающих после лучевой терапии (ЛТ) злокачественных новообразований, непосредственно связана с изучением отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на популяцию опухолевых клеток. Как в эксперименте, так и в клинической практике наряду с регрессией опухолей после больших лучевых нагрузок в ряде случаев отмечается феномен усиления радиорезистентности (РР) опухоли. Вторично повышенную РР могут также проявлять и опухолевые рецидивы, возникающие спустя какое-то время после радиотерапевтического излечения, что значительно снижает эффективность JIT. Преодоление приобретенной радиоустойчивости -одна из кардинальных проблем радиационной онкологии. Одним из подходов к её решению является исследование фундаментальных механизмов феномена клеточной PP.

До сих пор нет ясности за счет каких клеток или процессов происходит возобновление роста опухоли после облучения в высоких дозах. Не ясны и причины повышения резистентности рецидивов к последующему облучению.

Традиционно повышение РР опухоли к повторным курсам JIT связывают с селекцией устойчивых к радиации клонов после каждого лучевого воздействия, при котором "выбивается" наиболее чувствительная фракция клеток. Общеизвестно, что устойчивый к облучению резерв опухоли могут составлять высокодифференцированные клетки с. низкой митотической активностью или в состоянии гипоксии; клетки, находившиеся в момент облучения в резистентных фазах цикла, способные к более эффективной репарации повреждений. На знании этих закономерностей базируется J1T, направленная на оптимальный подбор и использование известных биологических, физических и химических факторов, модифицирующих лучевой поражение. Для подавления вторично устойчивых очагов опухолевого роста есть ещё один путь - повышение лучевой нагрузки. Однако в этом случае эффективность ЛТ ограничена тяжелыми осложнениями, связанными с повреждением нормальных радиочувствительных тканей.

Между тем резистентные клеточные клоны как предсуществуют в популяциях опухолевых клеток, так и могут возникать заново под действием радиации. Даже очень незначительное количество наследственно измененных клеток, обладающих селективным преимуществом, в ходе естественного отбора может дать начало новым клонам. В этом случае источником возобновленного, нередко ускоренного роста опухоли или появления радиорезистентных рецидивов будут уже генетически измененные клетки. Если устойчивость злокачественных клеток к облучению, обусловленную определенным периодом их жизнедеятельности, удается снизить при помощи модификаторов, то возникшую вследствие изменения генетического аппарата клетки трудно изменить даже в условиях интенсивной терапии. Таким образом, выяснение природы приобретенной РР имеет ключевое значение для JIT злокачественных новообразований. Без исследования механизмов приобретенной РР решение проблемы преодоления устойчивости опухоли к облучению может быть достигнуто лишь долгим и трудным эмпирическим путем.

К сожалению, этот важный для онкологии радиобиологический феномен остается слабоизученным. Информация в литературе о причинах повышения РР опухолевых клеток скудна и несистематична; до сих пор исследования в этом направлении носили больше описательный, феноменологический характер. Фактически, такое научное направление в радиобиологии отсутствует.

Среди причин крайне недостаточного внимания к данному феномену основными являются: сложность и многофакторность механизмов, определяющих развитие устойчивости опухолевой популяции к у-облучению, и отсутствие удовлетворительных радиобиологических моделей.

Целенаправленное изучение феномена приобретённой РР проводилось в единичных работах. Основной экспериментальный материал по приобретенной радиоустойчивости опухолей получен в опытах на животных в 50-60-х гг (Балмуханов и Ефимов 1971). Путем многократных последовательных облучений - трансплантаций асцитной карциномы Эрлиха был получен её РР вариант. В ходе сравнительного изучения свойств клеток из чувствительной и резистентной к у-облучению опухолей обнаружены изменения в кариотипе, уровне содержания сульфгидридных соединений, соотношении основных и кислых белков и ряд других отличий. В остальных исследованиях in vivo получены разрозненные и противоречивые данные, которые трудно связать между собой, чтобы сделать определенные выводы.

Для расшифровки фундаментальных механизмов, лежащих в основе опухолевой прогрессии, характеризующейся возникновением повышенной РР неоплазмы, необходимы целенаправленные исследования в культуре. Подходящей экспериментальной моделью могут являться стабильные линии потомков выживших после облучения опухолевых клеток. Однако анализ литературы показывает, как трудно in vitro смоделировать явление приобретенной PP. В разное время предпринимались попытки создания моделей для исследования механизмов приобретения опухолевыми клетками устойчивости к повторному облучению. Однако в большинстве случаев в культуре in vitro облучением не удавалось индуцировать повышения радиоустойчивости (Hill et al., 1990; Brown and Trott, 1994; Tarnawski et al., 1998); часто клетки из выделенных резистентных клонов оказывались или нежизнеспособными, или вскоре возвращались к исходному уровню чувствительности (Li et al., 2001). Стабильные линии радиорезистентных потомков облученных опухолевых клеток удалось получить лишь в единичных работах (Russell et al., 1995; Mitsuhashi et al., 1996).

Поэтому остаётся актуальной проблема разработки клеточной модели in vitro, на которой можно изучать процессы выживания облученной опухолевой популяции и выяснять причины возникновения в ней радиорезистентных клеточных вариантов. Исследование особенностей биологии потомков облученных опухолевых клеток в культуре даст возможность лучше понять механизмы, лежащие в основе появления радиоустойчивых рецидивов. Это с одной стороны позволит целенаправленно подобрать соответствующие средства, препятствующие самому их возникновению, а с другой, может оказаться полезным для разработки научно-обоснованных подходов по преодолению уже возникшей радиорезистентности.

Цель представленной работы - исследование механизмов приобретённой радиорезистентности опухолевых клеток. Для этого была поставлена задача смоделировать данное явление in vitro и разработать клеточную систему, состоящую из стабильных родственных линий злокачественных клеток, резко различающихся по радиочувствительности. На полученной клеточной модели провести комплексное изучение биологических свойств потомков опухолевых клеток, выживших после у-облучения в высоких дозах.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Развитие представлений о природе радиорезистентности неразрывно связано с прогрессом радиобиологии, эра которой началась с открытия рентгеновских лучей. Практическое использование ионизирующей радиации для подавления опухолевого роста базируется на данных научных исследований о механизмах, определяющих устойчивость опухолей к облучению.

Высокая устойчивость некоторых злокачественных новообразований к лучевому воздействию скорее всего связана с высокой надежностью их компенсаторных механизмов, в основе которых лежит в первую очередь работа репарационных систем, а также наличие гетерогенности клеточных популяций, где наряду с радиочувствительными клетками всегда присутствуют радиорезистентные (Go и S-клетки, клетки из гипоксических очагов и др.). К этим же механизмам можно отнести и выработанный в процессе эволюции сложный комплекс реакций - от адаптационно-неспецифических, до конкретных специфических изменений на функциональном, метаболическом, молекулярном и др. уровнях клеточной организации.

По-видимому, в зависимости от силы воздействия активизируются различные системы защиты. Скорее всего именно этот факт обусловливает отсутствие монотонной зависимости терапевтического эффекта от дозы радиации, что отмечено как в клинической практике, так и в эксперименте. Так, при JIT опухолей в области меньших доз частота излечения нередко оказывается большей по сравнению с предсказанной, а при больших дозах, напротив, меньше, чем ожидалось (Ярмоненко, 1977).

Условно можно подразделить дозы облучения на малые, средние и большие. Несмотря на отсутствие точного определения, под малыми подразумевают дозы, соответствующие начальному участку дозовой кривой (как правило, менее 1 Гр), а по биологическому эффекту - оказывающие стимулирующее воздействие на жизненно важные клеточные процессы. При этом могут обнаруживаться и так называемые парадоксальные эффекты, когда при снижении дозовых нагрузок эффективность поражающего действия у-излучения возрастает (Sheldon and Fowler, 1973; Stephens et al., 1978). Этот феномен связывают с тем, что индуцированное .высокими дозами большее число повреждений инициирует соответственно и запуск более эффективных систем защиты (пороговый характер инициирования репарационных систем), чем в случае низких доз (Lambin et al., 1994). Иными словами, эффект защиты перекрывает эффект поражения.

Пожалуй, наиболее полно изучено действие радиации на биосистемы в области линейно-квадратичной дозовой зависимости (средние дозы), так как именно этот диапазон доз в основном используется при лучевой терапии опухолей. К настоящему времени получены многочисленные данные исследований in vitro и in vivo, на основании которых достаточно хорошо установлены механизмы восстановления клеток. В области доз начального этапа прямолинейного отрезка дозовой кривой (1-3 Гр) репопуляция опухоли в основном осуществляется системами репарации, а при больших дозах (5-8 Гр) - численность клеток восстанавливается, благодаря РР клеточному резерву (селекция) или иным процессам. Конечно, в зависимости от гистогенеза опухоли, степени её прогрессии и др. причин, пороговые дозы, при которых запускаются те или иные восстановительные механизмы, различаются (поэтому приведенные показатели носят достаточно условный характер).

Отдаленные эффекты действия высоких доз ионизирующего излучения (при которых клеточная выживаемость составляет сотые доли процента) изучены явно недостаточно, а имеющиеся сведения противоречивы. С одной стороны, многочисленные экспериментальные данные in vitro четко показывают, что падение клеточной выживаемости по мере возрастания дозы носит экспоненциальный характер. Согласно классическим дозовым кривым, в области больших доз облучения доля выживших клеток стремится к нулю, то есть, вероятность появления полноценного жизнеспособного потомства должна быть ничтожно малой. С другой стороны, имеются экспериментальные данные, свидетельствующие о способности опухолевых клеток возобновлять рост и давать жизнеспособное потомство при воздействии сверхлетальных доз радиации (Ефимов и др., 1975; Бахтин и др., 1989). Объяснить подобные факты функционированием только указанных систем защиты (репарацией или селекцией предсуществующих радиорезистентных клонов) трудно.

Отражением немонотонного характера зависимости радиотерапевтического эффекта от дозы в клинической практике являются случаи, когда в ходе, казалось бы, успешного лучевого лечения новообразование теряет свою первоначальную чувствительность к радиации и становится более радиоустойчивым. Вторично повышенную РР могут приобретать и рецидивы опухолевого роста, возникающие спустя какое-то время после полного курса JIT (60-70 Гр). Появление рецидивов и повышение их резистентности к повторным курсам облучения является одним из основных факторов, снижающих эффективность радиотерапии. Одной из основных причин крайне недостаточного исследования проблемы вторично приобретенной РР опухолевых клеток является отсутствие адекватных радиобиологических моделей.

По-видимому, при значительных лучевых нагрузках индуцируются дополнительные механизмы защиты (возможно, функционирующие на многоклеточном уровне), существование которых обеспечивает выживание опухолевой популяции при сверхсильных повреждающих воздействиях. К сожалению, к настоящему времени они изучены очень слабо.

Для разработки научно-обоснованных подходов преодоления приобретенной РР опухолей необходимы целенаправленные экспериментальные исследования, теоретической базой которых должны служить накопленные к настоящему времени знания о факторах радиоустойчивости. Этим вопросам - первичной и приобретенной в ходе лучевого воздействия радиорезистентности опухолей - посвящен обзор литературы.