научная статья по теме КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ ERWINIA CAROTOVORA, ТРАНСАМИНИРУЮЩИХ ФЕНИЛПИРУВАТ Химия

Текст научной статьи на тему «КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ ERWINIA CAROTOVORA, ТРАНСАМИНИРУЮЩИХ ФЕНИЛПИРУВАТ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 2, с. 129-135

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ Erwinia carotovora, ТРАНСАМИНИРУЮЩИХ ФЕНИЛПИРУВАТ

Г. П. Алебян, А. С. Сагиян

НПЦ "Армбиотехнология"НАНРА, Ереван 0056, Армения e-mail: anipaloyan@yahoo.com, armbiotech@gmail.com Поступила в редакцию 7.08.2012 г.

Рассчитаны Кт для L-фенилаланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты и соответствующих кетокислот, а также Vmax для пар субстратов: L-фенилаланин — 2-кетоглутарат, L-фе-нилаланин — оксалоацетат, L-глутаминовая кислота — фенилпируват и L-аспарагиновая кислота — фенилпируват для аминотрансфераз PAT1, PAT2 и PAT3 Erwinia carotovora subsp. carotovora ИНМИА № 8724, катализирующих переаминирование фенилпирувата. Аминотрансфераза PAT3 ингибирова-лась 2-кетоглутаратом (Ks — 10.23 ± 3.20 мМ) и оксалоацетатом (Ks — 3.73 ± 1.99 мМ). Конкурентным ингибитором РАТ1 являлся L-ß-(N-бензиламино)аланин при использовании в качестве субстрата L-фе-нилаланина (K = 0.32 ± 0.07 мМ, Km = 0.45 ± 0.1 мМ, Vmax = 11.6 ± 0.4 ед./мг) при концентрации 2-ке-тоглутарата в реакционной среде 25 мМ. L-ß-(N-метиламино)аланин — бесконкурентный ингибитор для PAT3 при той же паре субстратов (Kj= 138.4 ± 95.4 мМ, Km = 13.7 ± 3.9 мМ, Vmax = 18.6 ± ± 4.1 ед./мг) и концентрации 2-кетоглутарата 2 мМ в реакционной среде.

Исследованы L-стереоизомеры некоторых небелковых аналогов ароматических аминокислот в качестве субстратов для PAT1, PAT2 и PAT3.

С тех пор, как в 1937 г. А.Е. Браунштейн и М.Г. Крицман [1] открыли реакцию трансами-нирования, выделено, очищено и изучено множество аминотрансфераз. Аминотрансферазы — пиридоксальфосфат-зависимые ферменты [КФ 2.6.1] и катализируют обратимую ракцию трансаминирования, в которой происходит перенос альфа-аминогруппы с аминокислоты на 2-кетокислоту с образованием кетокислоты и аминокислоты по механизму пинг-понг-би-би.

Исследуемые в данной работе аспартат- и ароматические аминотрансферазы, хорошо изучены у Escherichia coli [2—5], Bacillus subtilis [6, 7], Bacillus sp. [8], коринеформных бактерий [9, 10], представителей рода Pseudomonas [11, 12], Klebsiella aerogenes [13], актиномицета Amycolatopsis metha-nolica [14], лактококка Lactococcus lactis [15], архе-бактерий [16], гипертермофильных архебактерий Thermococcus litoralis [17], Pyrococcus horikoshii [18] и Pyrococcusfuriosus [19].

Реакции, катализируемые аминотрансфераза-ми, участвуют в биосинтезе различных аминокислот у многих микроорганизмов и вызывают повышенный интерес исследователей возможностью осуществления аналогичных процессов в прикладных целях для синтеза ароматических аминокислот из их синтетических предшественников. Практический интерес преставляет способ получения L-фенилаланина. Реакция может осуществ-

ляться как в живых клетках микроорганизмов, так и иммобилизованными клетками и ферментами аспартат и/или ароматическими аминотрансфера-зами [20—22].

Ранее нами был разработан способ получения L-фенилаланина из фенилпировиноградной кислоты с применением аминотрансфераз Erwinia carotovora [23]. Также нами были выделены, очищены и охарактеризованы ферменты E. carotovora, трансаминирующие фенилпируват [24].

Цель работы — изучение каталитических свойств и субстратной специфичности ферментов E. carotovora, трансаминирующих фенилпируват.

В работе были использованы аминотрансферазы PAT1 (phenylalanine transaminase 1), PAT2 и PAT3 E. carotovora способ выделения и очистки которых описан [24]. В работе было выдвинуто предположение, что PAT1 и PAT2 являются ароматическими аминотрансферазами а PAT3 — ас-партат-аминотрансферазой.

Все кинетические исследования проводились в реакционной среде объемом 200 мкл, содержа-шей: аминокислоты и кетокислоты, (концентрации указаны ниже), 0.05 мМ пиридоксальфосфат (ПЛФ), 0.1 М трис-HCl буфер, pH 8.5, и ферментный препарат в необходимом количестве. Скоро-

сти реакции определяли по накоплению продук-тов-кетокислот — фенилпирувата, 2-кетоглутарата или оксалоацетата. Концентрацию фенилпирувата определяли, измеряя оптическое поглощение в присутствии 1.0 М ШОН (е320 = 17 500 М-1 см-1) [3]. Концентрацию 2-кетоглутарата и оксалоацетата рассчитывали по окислению НАДН (е320 = = 6220 М-1 см-1) в присутствии глутаматдегидро-геназы или малатдегидрогеназы соответственно. Концентрацию белка определяли методом Гровса и ДеИвиса [25].

Для реакции с обычным механизмом пинг-понг би-би значения кажущихся констант Миха-элиса - Кт1 и Кт2 и максимальной скорости реакции - Ктах определяли из уравнения (1) [26], измеряя активности ферментов в реакционнои среде с 16 сочетаниями концентраций аминокислоты (1.0, 2.5, 3.75, 10.0 мМ и кетокислоты (0.5, 1.0, 2.0, 5.0 мМ). Кинетические параметры реакций аминотрансфераз РАТ1, РАТ2 и РАТ3 исследовали для пар субстратов: Ь-фенилаланин -оксалоацетат, Ь-фенилаланин - 2-кетоглутарат, Ь-аспарагиновая кислота - фенилпируват и Ь-глу-таминовая кислота - фенилпируват, за исключением реакций, катализируемых РАТ3, в которых наблюдалось субстратное ингибирование (пары субстратов Ь-фенилаланин - оксалоацетат, Ь-фе-нилаланин - 2-кетоглутарат).

Где: V - скорость реакции, и S2 - концентрации аминокислоты и кетокислоты, соответственно, Кт1 и Кт2 - константы Михаэлиса для аминокислоты и кетокислоты, соответственно.

В случаях субстратного ингибирования (инги-бирование РАТ3 2-кетоглутаратом и оксалоацета-том) Кт для фенилаланина определяли из простого уравнения Михаэлиса-Ментен при концентрациях Ь-фенилаланина - 1.0; 2.5, 5.0, 10.0, 25.0, 40.0 и 50.0 мМ и максимальной неингибирующей концентрации кетокислоты (2-кетоглутарат - 2.0 и оксалоацетат - 2.0 мМ). При субстратном инги-бировании Кт и К (коэффициент субстратного ингибирования) для кетокислот определяли из уравнения (2) [26] при концентрациях кетокис-лот - 0.25, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, и 12.5 мМ и концентрации Ь-фенилаланина - 50.0 мМ.

нина, 5.0 мМ 2-кетоглутарата и 5.0 мМ тестируемой небелковой аминокислоты при рН 8.5.

При изучении механизма ингибирования РАТ1 Ь-Р-(М-бензиламино)аланином Кт, К и Утзх определяли из уравнения конкурентного ингибирования (3) [26], измеряя активность фермента при сочетании 16 различных концентраций Ь-фе-нилаланина (1.0, 2.5, 3.75, 10.0 мМ) и Ь-Р-(М-бензиламино)аланина (0, 0.625, 2.5, 6.25 мМ) при наличии в реакционной среде 10 мМ 2-кето-глутарата.

При изучении механизма ингибирования РАТ3 Ь-Р-(М-метиламино)аланином Кт, К и Утзх определяли из уравнения бесконкурентного ингибирования (4) [26], выведенного нами по алгоритму, описанному у Кинга и Альтмана [27], измеряя активность фермента при 16 различных сочетаниях концентраций Ь-фенилаланина (8.0, 20.0, 30.0, 80.0 мМ) и Ь-Р-(М-метиламино)аланина (0, 2.5, 10.0, 25.0 мМ) при наличии в реакционной среде 2.0 мМ 2-кетоглутарата.

Для выявления ингибирующего действия Ь-Р-(М-бензиламино)аланина и Ь-Р-(М-метилами-но)аланина активность ферментов измеряли при наличии в реакционной среде 10 мМ Ь-фенилала-

Во всех приведенных выше кинетических исследованиях полученные результаты анализировали графически для выявления механизмов реакций [26]. Далее значения соответствующих кинетических параметров и их стандартные ошибки рассчитывали методом многомерного линейного регрессионного анализа с использованием разработанных нами программ на языке Gauss 4.0.

Субстратную специфичность PAT1, PAT2 и PAT3 E. carotovora при использовании в качестве субстратов вновь синтезированных небелковых аминокислот определяли при концентрации доноров аминогрупп 25.0 мМ, а в качестве акцептора аминогрупп использовали 25.0 мМ 2-кетоглутаровую кислоту (2.0 мМ для PAT3). Активность ферментов определяли по скорости накопления L-глутаминовой кислоты. Концентрацию L-глутаминовой кислоты определяли качественно — методом тонкослойной хромотографии на силикагелевых пластинках "Silufol" (Чехия) [28] и количественно — с помощью глутаматдегидрогеназы по восстановлению НАД в трис-гидразиновом буфере.

В работе использовали следующие материалы и реактивы: трис, ПЛФ, НАДН, НАД, глутаматдегид-рогеназа, малатдегидрогеназа, 2-кетоглутаровая кислота и оксалоацетат фирмы "Serva" (Германия); L-ß-(2-Br-фенил)аланин, L-ß-(4-Br-фенил)аланин, L-a-метил-ß-(2-Br-фенил)аланин, L-ß-гидрокси-ß-(3-Br-2-метоксифенил)аланин, L-a-метил-

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ Erwinia carotovora

0.4 0.6 0.8 1.0 1/^-фенилаланин], мМ-1

1/V, ед./мг 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

1/^-аспарагиновая кислота], мМ-1

Рис. 1. Зависимость скорости реакции от концентраций субстратов аминотрансферазы Е. еаШоуота в координатах Лайнуивера—Берка. а — концентрации оксалоацетата: 1 - 0.5, 2 - 1.0, 3 - 2.0, 4 - 5.0 мМ; б — концентрации фенилпи-рувата: 1 - 0.5, 2 - 1.0, 3 - 2.0, 4 - 5.0 мМ.

фенилаланин, Ь-Р-(2^-фенил)аланин, Ь-Р-(4^-фенил)аланин, Ь-а^-фенилаланин, Ь-О-бензил-тирозин, Ь-Р-(М-бензиламино)аланин, Ь-Р-(М-метиламино)аланин, Ь-О-бензил-а-ме-тил-тирозин, Ь-(2-F)-триптофан синтезированы в НПЦ "Армбиотехнология", остальные реактивы произведены в странах СНГ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведен анализ кинетических параметров (Кт, ^ж) аминотрансфераз РАТ1, РАТ2 и РАТ3 Е. еато1о-уота [25], участвующих в переаминировании фенил-пирувата. Реакции переаминирования исследовались для пар субстратов: Ь-фенилаланин - 2-кетоглутарат, Ь-фенилаланин - оксалоацетат, Ь-аспарагиновая кислота - фенилпируват и Ь-глутаминовая кислота - фенилпируват. Для РАТ1 и РАТ2 зависимость скоростей реакций от концентрации варьируемого субстрата при постоянном значении косубстрата в координатах Лайнуивера-Берка представлены параллельными прямыми линиями для различных значений косубстрата, что указывает на протекание реакции по механизму типа пинг-понг би-би, как и в случае других аминотрансфераз [29, 30]. Типичные результаты для аминотрансферазы РАТ1 в случае пар су

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎