Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему: Препараты на основе иммуноактивного дипептида и его координационных соединений с ионом цинка
Автореферат диссертации по медицине на тему Препараты на основе иммуноактивного дипептида и его координационных соединений с ионом цинка
На правах рукописи
Бобиев Гуломкодир Муккамолович
ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОАКТИВНОГО ДИПЕПТИДА И ЕГО КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИОНОМ ЦИНКА
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук
14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России и в Таджикском государственном педагогическом университете имени С. Айни Республики Таджикистан
доктор фармацевтических наук,
профессор Бунятян Наталья Дмитриевна
доктор медицинских наук,
профессор Меркулов Вадим Анатольевич
Багирова Валерия Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, директор по науке и развитию ОАО «Новосибхимфарм»,
Чистяков Виктор Владимирович - доктор фармацевтических наук, профессор кафедры аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.
Каленикова Елена Игоревна - доктор фармацевтических наук, доцент, заведующая кафедрой фармации ГУНУ факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова.
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН
Защита состоится 2013 г. в часов на заседании
диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова» Минздравсоцразвития России по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу; 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49
Автореферат разослан «_»_2013 г.
диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время установлено, что нарушение функции иммунной системы организма зачастую приводит к возникновению широкого круга заболеваний. С целью профилактики таких патологий успешно используются иммуномодулирующие препараты, нередко полученные синтетическим путем. Однако, являясь чужеродными для живого организма, они могут провоцировать возникновение неблагоприятных побочных реакций (НПР). Альтернативой синтетическим средствам могут стать препараты, созданные на основе эндогенных иммуномодулирующих пептидов. В 70-х годах XX века из тимуса были получены экстракты, обладающие иммуномодулирующими свойствами (В.Г. Морозов и соавт., 2000). На основе этих экстрактов разработано несколько препаратов - тималин, тактивин и др., представляющих собой смесь большого количества пептидов, из которых были выделены индивидуальные пептиды и изучены их биологические свойства. При этом установлено, что некоторые триптофансодержащие дипептиды обладают иммуномодулирующими свойствами, в том числе Н-Ие-Тгр-ОН и Н-С1и-Тгр-ОН, на основе которого создан препарат тимоген (Яковлев Г.М. и соавт., 1990). В отличие от тимогена, дипептид Н-11е-Тгр-ОН оказывал влияние как на Т-хелперные (СБ4+), так и на Т-супрессорные (СБ8+) клетки, что позволило сделать предположение о том, что лекарственные средства, изготовленные на его основе должны обладать более широким спектром иммунологической активности. Преимущество таких препаратов состоит в том, что они не являются чужеродными организму, вследствие чего не обладают токсичностью и не оказывают НПР. Опыт применения тимогена, вилона, иммунофана и других препаратов, являющихся синтетическими пептидами, соответствующими по аминокислотной последовательности природным, подтвердил справедливость данного утверждения. Все вышеизложенное показывает актуальность разработки новых
иммуномодулирующих препаратов на основе синтетических пептидов эндогенного происхождения, обладающих иммунотропной активностью.
Малое содержание этих пептидов в организме и сложность выделения их из тимуса в чистом виде обуславливают особую актуальность разработки оптимальных методов их химического синтеза.
Известно, что в функционировании иммунной системы важную роль играют некоторые микроэлементы, наиболее значимым из которых с этой точки зрения является цинк. Роль его в клеточном и гуморальном иммунитете уже ни у кого не вызывает сомнений (Кудрин A.B. и соавт., 2000, 2007; Takahashi К., 1999; Tran C.D., 1999; Segurado М., 1999).
Установлено, что при комплексообразовании ионов различных металлов с биологически активными соединениями, в том числе иммуноактивными, происходит увеличение специфической и расширение спектра биологической активности последних. Однако до настоящего времени не был разработан ни один лекарственный препарат на основе биокоординационных соединений иммунологически активных микроэлементов и низкомолекулярных пептидов. В связи с этим, представляется актуальным изучение путей комплексообразования низкомолекулярных иммуноактивных пептидов с ионами биологически активных металлов, таких как цинк; создание на их основе иммуномодулирующих препаратов; разработка методов стандартизации и технологических схем производства.
Цель и задачи исследования: разработка методов получения иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с ионом цинка и создание на их основе новых иммуномодулирующих препаратов.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Оптимизировать пути синтеза тимопентина и его гексапептидного аналога, синтезировать потенциально иммуноактивные лизин-, серин- и тирозинсодержащие дипептиды и тирозинсодержащие тетрапептиды, изучить применимость N-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида изолейцил-триптофан.
2. Определить параметры стандартизации и методики анализа субстанции, стандартного образца и препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан (тимогар) с использованием
методов спектрофотометрии, тонкослойной и
высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3. Изучить взаимодействие лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка с использованием методов рН-метрического и окс-редметрического титрования.
4. Изучить влияние соле- и комплексообразования на хроматографическую подвижность триптофансодержащих дипептидов.
5. Разработать условия хроматографирования методом ВЭЖХ дипептида изолейцил-триптофан и его координационных соединений с ионом цинка.
6. Изучить стабильность препаратов тимогар и тимоцин в условиях длительного хранения согласно требованияям разработанных фармакопейных статей.
7. Разработать нормативную документацию на препараты тимогар и тимоцин.
8. Провести сравнительноые фармакологические исследования тимогара и его натриевой соли, завешить доклинические и клинические исследования препаратов тимогар и тимоцин.
Научная новнзна работы. Впервые разработаны методы стандартизации иммуномодулирующих препаратов тимогар -0,01% водный раствор дипептида и тимоцин - 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка; исходных фармацевтических субстанций и их стандартных образцов.
Впервые изучена возможность использования ПСА-метода для синтеза аналогов тимопентина и Ы-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида Н-Ие-Тгр-ОН. Экспериментально подтверждено преимущество использования активированных (пентафторфениловых) эфиров при получении
низкомолекулярных тимусных пептидов.
Получены координационные соединения лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов Н-С1у-Тгр-ОН и Н-11е-Тгр-ОН с ионом Zn2+. Использование окислительной функции позволило установить состав координационных соединений + и дипептида Н-11е-Тгр-ОН. Разработаны методы стандартизации
триптофансодержащего дипептида и его координационных соединений с ионом цинка, основанные на использовании современных физико-химических методов анализа.
Установлено, что препарат тимогар является высокоэффективным при лечении нефрологических, ревматологических и пульмонологических заболеваний человека. Показана эффективность монотерапии тимогаром при лечении псориаза. Впервые показано, что тимоцин (157 мкг/мл) не обладает аллергизирующими, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами. Отмечено сокращение срока и увеличение эффективности лечения заболеваний человека, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний при совместном применении тимоцина (157 мкг/мл) с химиотерапевтическими лекарственными средствами.
Практическая значимость результатов исследования.
Разработаны методы стандартизации новых
иммуномодулирующих препаратов тимогар, тимоцин, включенные в 5 Фармакопейных статей (ФСП 42 Tj-00001-08, 42 Tj-00002-08, ФСП 42-Tj-0001-08, ФС 42-Tj-0002-08, 42-Tj-0003-08), утвержденных Министерством Здравоохранения Республики Таджикистан. Разработанные препараты тимогар и тимоцин зарегистрированы в Республике Таджикистан (per. № 000084Т и 000085Т), препарат тимоцин также зарегистрирован в Туркмении (per. №006371) и Кыргызской Республике (КР № 7137). Препараты тимогар и тимоцин внедрены в медицинскую и ветеринарную практику. Получен 1 патент Республики Таджикистан (№ TJ 453, приоритет от 19.10.2006 г.).
Связь задач исследований с проблемным планом.
Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора по теме: «Разработка принципов и методов контроля различных групп биотехнологических препаратов» и планами исследований кафедры органической и биологической химии Таджикского государственного педагогического университета имени С. Айни Республики Таджикистан по теме: «Исследование низкомолекулярных иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с биометаллами».
Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003), третьей республиканской научной конференции биохимиков РТ «Вклад биохимиков в развитие биологической науки» (Душанбе, 2003), научно-практической конференции «Аналитик кимё ва экологиянинг долзарб муаммолари» (Самарканд, 2006), научной конференции «Проблемы клинической онкологии» (Душанбе, 2008), совместной республиканской научно-практической конференции «Перспективы развития фундаментальных медицинских наук в Таджикистане и 56-ой годичной конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино «Перспективы развития семейной медицины в Таджикистане» (Душанбе, 2008), международной конференции «Вакцинология-2008» (Москва, 2008), международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009), VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Душанбе, 2010), республиканской конференции «Проблемы современной координационной химии» (Душанбе, 2011), международной конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств биологически активных соединений» (Душанбе, 2011), международной научно-практической конференции «Ислохоти сохаи маориф ва шаклгирии муносибатхои бозаргони» (Душанбе, 2011), на совместном заседании секции №1 и секции №2 Ученого совета Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России.
Личный вклад автора. Автором осуществлен выбор научного направления, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах научно-практического исследования. Автором предложены схемы синтеза изучаемых пептидов, разработана технологическая схема их производства. Автором разработана технологическая схема производства препарата тимогар, методы контроля качества препарата, изучена стабильность тимоцина в процессе длительного хранения и
установлен срок его годности. При личном участии автора проведены клинические испытания тимоцина и тимогара, подтвердившие его высокую эффективность.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 научная работа, в том числе одна монография и 1 патент Республики Таджикистан. 23 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Оптимальные методы синтеза тимопентина и его гексапептидного аналога, гистидинсодержащего аналога дипептида изолейцил-триптофан, серин- и лизинсодержащих дипептидов, тирозинсодержащих тетрапептидов.
2. Результаты исследований координационных соединений лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка.
3. Результаты разработки методик анализа и стандартизация стандартных образцов, субстанций и лекарственных форм на основе дипептида H-Ue-Trp-OH и его координационного соединения с ионом цинка.
4. Результаты фармакологических и клинических испытаний разработанных препаратов тимогар и тимоцин, а также натриевой соли тимогара.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 345 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, списка литературы, включающего 264 источника, в том числе 87 на иностранных языках, приложения. Работа включает 37 рисунков и 49 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования. В работе использовали аминокислоты L-ряда и производные аминокислот («Reanal», Венгрия) или производные аминокислот, полученные по стандартным методикам (Гершкович A.A. и соавт., 1992). Индивидуальность и степень чистоты полученных соединений проверяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на
пластинках «Silufol UV-254» («Chemapol», Чехия) и «Merck» (Германия») в следующих системах растворителей: СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 18:2:1 (А), н-бутанол-пиридин-СН3СООН-Н20, 5:5:1:4 (Б), СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 60:45:20 (В), этилацетат-С6Н6, 3:2 (Г), СНС13-этилацетат-СН3ОН-СН3СООН, 9:3:1:0,3 (Д), СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 32:2:1 (Е), н-бутанол-СН3С00Н-Н20, 3:1:1 (Ж), н-бутан0л-пиридин-СН3СООН-Н2О, 30:20:6:24 (3), СН3С00Н-Н20-СН30Н-СНС13, 7:3:1:1 (И). Проявление хроматограмм проводили последовательной обработкой С12 и насыщенным раствором бензидина в 2% СН3СООН.
При каталитическом гидрировании использовали 10% палладий на активированном угле фирмы «Fluka» (Германия).
Удельное оптическое вращение определяли в СН3ОН на автоматическом цифровом поляриметре «Perkin-Elmer-241» (США), длина кюветы 1 дм.
рН-метрические и потенциометрические исследования проводили на рН-иономере MS-20 (Чехия).
Температуру плавления (не скорректирована) определяли на нагревательном столике «Boetius» (Германия).
Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 мм.
Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на приборе Shimadzu LC-20 (Япония); элюирование проводили на колонке Discovery С18 (250x4,6 мм, размер частиц 5 мкм), в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и фосфатного буфера с pH 7,4 (40:60), скорость потока составляла 1 мл/мин, детектирование проводили при длинах волн 254 и 280 нм и времени элюирования 30 мин.
Для колоночной хроматографии использовали силикагель L-100/160 («Chemapol», Чехия) и сефадекс G-25 («Merck», Германия).
Аминокислотный анализ свободных пептидов (после 24-часового гидролиза в 6 н HCl при 105°С в запаянных под вакуумом ампулах) проводили на аминокислотном анализаторе «JLC-GAN» («JEOL», Япония). Гидролиз триптофансодержащих пептидов осуществляли 3 М раствором п-толуолсульфокислоты в течение 48 ч при 110°С.
Растворы веществ упаривали под вакуумом при температуре не выше 40°С.
При стандартизации препаратов использовали методы и методики, включенные в соответствующие статьи Государственной фармакопеи РФ XI и XII изданий.
Фармакологические исследования полученных соединений и разработанных препаратов изучали на белых мышах, кроликах, овцах, телятах 2-6-месячного возраста и взрослом крупном рогатом скоте согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под редакцией Р.У. Хабриева. М., 2005 г.)
Препараты тимоген, тимогар, тимоцин вводили внутримышечно или подкожно в зависимости от поставленного опыта.
В опытах использовали ассоциированную вакцину против рота-, коронавирусных энтеритов и колибактериоза телят, изготовленную Всероссийским НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ), в дозе 5 мл на голову, живую культуральную противотейлериозную вакцину ВИЭВ в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток). Для обнаружения антител к рота-, коронавирусу и E.coli применяли, соответственно, иммуноферментный анализ (ИФА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и агглютинации (РА) (Соколова H.J1. и соавт., 1987), противотейлерийных антител - реакцию длительного связывания комплемента (РДСК) и ИФА.
Бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови животных определяли согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под редакцией Р.У. Хабриева. М., 2005 г.), биохимические показатели крови - «Методическим указаниям по применению унифицированных биохимических методов исследований крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях» (Москва, 1991).
Получение низкомолекулярных тимусных пептидов Оптимизация условий синтеза аналогов тимонентина
Ранее (Бобиев Г.М., 2000) при синтезе тимопентина путем ступенчатого наращивания пептидной цепи методом
активированных (1\Г-оксисукцинимидных и п-нитрофениловых) эфиров общий выход свободного пентапептида составил 30,8%. Для повышения общего выхода тимопентина был проведен его новый синтез аналогичным путем, но с использованием в качестве активированных пентафторфениловых эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната. Общий выход тимопентина, полученного по этой схеме, составил 39,8%.
При синтезе гексапептидного аналога тимопентина Н-А^-Ьуз-Азр-Уа1-Туг-А^-ОН методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-конца, общий выход гексапептида составил 28,2% (Бобиев Г.М., 2000).
Для повышения общего выхода гексапептида был использован ПСА-метод, заключающийся в последовательном наращивании пептидной цепи методом смешанных ангидридов без промежуточного выделения и очистки пептида при использовании на каждой стадии конденсации избытка ацилирующего агента - смешанного ангидрида Ы-защищенной аминокислоты. В качестве временной КГ-защитной группы использовали трет-бутилоксикарбонильную группу, которую удаляли обработкой НС1 в этилацетате. Эта замена позволила избежать механических потерь целевого продукта при отфильтровывании катализатора на каждой стадии конденсации, что отмечалось при синтезе методом активированных эфиров.
При синтезе с использованием ПСА-метода общий выход составил 25,3%. В этом случае применение ПСА-метода и изменение выбора защитных групп не привело к повышению общего выхода гексапептида. Это, вероятно, связано с использованием нитрогруппы для защиты гуанидиновой группы. Вследствие этого, для синтеза гексапептидного аналога тимопентина оптимальным является ступенчатое наращивание пептидной цепи методом активированных эфиров.
После этого по аналогичной схеме ПСА-методом был синтезирован тимопентин с общим выходом 48,3%, тогда как при синтезе методом активированных эфиров - 39,8%. В этом случае применение ПСА-метода оказалось более выгодным.
Следовательно, оптимальными методами для синтеза тимопентина и его аналогов является ступенчатое наращивание пептидной цепи методами активированных эфиров и смешанных ангидридов.
Синтез трипептидного аналога дипептида изолейцил-триптофан
Известно, что гистидин способствует защите мембранных рецепторов и клеточных мембран от неблагоприятных факторов окружающей среды путем нейтрализации избыточных концентраций протонов, ионов металлов переменной валентности и свободных радикалов (Морозов В.Г. и др., 2000). Поэтому было предположено, что введение остатка гистидина на 1^-конец иммунологически активного дипептида изолейцил-триптофан будет способствовать повышению его специфической активности.
Для проверки этого предположения нами был синтезирован гистидинсодержащий аналог иммуноактивного триптофан-содержащего дипептида - трипептид гистидил-изолейцил-триптофан.
Синтез проводили ступенчатым наращиванием пептидной цепи начиная с С-конца методом активированных эфиров с использованием в качестве последних п-нитрофениловых, полученных карбодиимидным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дициклогексилкарбоди-имида.
Общий выход конечного трипептида гистидил-изолейцил-триптофан составил 44%, что позволяет считать метод активированных эфиров одним из оптимальных для синтеза гистидин- и триптофансодержащих пептидов.
Также была изучена возможность применения М-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида изолейцил-триптофан. При этом в реакцию образования М-карбоксиангидрида вводили свободный изолейцин. Свободный дипептид очищали перекристаллизацией из воды. Общий выход свободного дипептида составил 54,7%. Полученный дипептид был охарактеризован данными ТСХ, ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс-спектроскопии (рис.1).
Синтез тирозинсодержащих тетрапептидов
Установлено, что некоторые низкомолекулярные иммуноактивные пептиды, являющиеся по биологическим функциям тимомиметиками, обладают также и нейротропной активностью (Ветлугина Т.П., 2000; Найденова Н. и др., 2001; Козловская Г.В. и др., 2005, 189).
«"Иг»»« «OUHviD» ШЙЯ12 1 22 Л
fc r-4 i S.a.?% Ti Cw»<a im»«
Рис.1. Масс-спектр дипептида изолейцил-триптофан.
Поэтому весьма вероятным является наличие иммунотропной активности у низкомолекулярный нейротропных пептидов. Одним из таких нейропептидов является дерморфин, представляющий собой амид гексапептида с последовательностью D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2
(Коршунова Г. А., Сумбатян Н.В., 1989). Сообщалось о применении аналога дерморфина при лечении хронических воспалительных заболеваниях легких (Гусева O.E., 2010). Установлено, что наиболее важными аминокислотными остатками в молекуле дерморфина являются Туг и Phe (Kreil G., 1994). Также известно, что тирозин входит в состав многих биологически активных пептидов, в том числе и обладающих нейро- и иммунотропной активностью (Мясоедов Н.Ф., 2005). Поэтому было решено синтезировать тирозинсодержащие пептиды H-Tyr-Lys-Phe-Gly-OH и H-Tyr-Tyr-Pro-Ser-NH2, являющиеся модифицированными фрагментами дерморфина с целью изучения их иммуностимулирующей активности.
Тетрапептид H-Tyr-Lys-Phe-Gly-OH был синтезирован методом активированных эфиров путем ступенчатого
наращивания пептидной цепи начиная с С-конца. Общий выход тетрапептида в этом случае составил 59%.
Синтез потенциально иммуноактивных дипептидов
Поскольку лизин входит в состав активного центра тимопоэтина, дипептид Н-Ьуэ-01и-0Н стимулирует экспрессию рецепторов тимоцитов, обработанных трипсином и оказывает выраженное стимулирующее воздействие на экспрессию С04+ рецепторов лимфоцитов крови (Морозов В.Г. и др., 2000), аргинин обладает иммунологической активностью был синтезирован ряд лизинсодержащих дипептидов с целью изучения их иммунологической активности.
Дипептиды Н-Рго-Ьуэ-ОН, Н-Ьуз-Ъуэ-ОН, Н-Ьуэ-^у-ОН, Н-А1а-Ьуз-ОН, Н-А1а-8ег-ОН были синтезированы методом смешанных ангидридов с использованием в качестве конденсирующего реагента изобутилхлорформиата.
В качестве временной №-защитной группы использовали трет-бутилоксикарбонильную группу, только при синтезе дипептида Н-А1а-8ег-ОН для этой цели была использована бензилоксикарбонильная группа.
е-Аминогруппу лизина защищали бензилоксикарбонильной группой, карбоксильную группу С-концевой аминокислоты -сложноэфирной метальной группой. Трет-бутилоксикарбонильную группу снимали действием НС1 в этилацетате, сложноэфирную метальную группу снимали действием гидроксида натрия, карбобензоксигруппу - каталитическим гидрированием в присутствии 5%-ного палладия на активированном угле. Дипептиды Н-Авп-Туг-ОН и Н-А^-Ьуэ-ОН синтезировали методом активированных (п-нитрофениловых) эфиров. Выбор защитных групп и методов удаления был таким же, как и в предыдущем случае. Отличительным являлось использование нитрогруппы для защиты гуанидиновой группы аргинина и использование солеобразования для защиты карбоксильной группы остатка лизина. Нитрогруппу в конце синтеза удаляли каталитическим гидрированием. При синтезе трипептида Н-Ак-Ьув-Ьуз-ОН использовали такие же защитные группы и методы их удаления, что и при синтезе дипептидов. Трипептид синтезировали методом смешанных ангидридов путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-конца.
Резюмируя проведенные исследования по синтезу низкомолекулярных иммуноактивных пептидов можно заключить, что из всех изученных методов синтеза пептидов, применение метода активированных эфиров является оптимальным при использовании тактики максимальной защиты, что позволяет повысить выход пептидов на стадиях конденсации и снизить механические потери при очистке конечного продукта. Однако синтез каждого пептида требует индивидуального подхода к выбору защитных групп и активированных эфиров.
Химико-фармацевтическое исследование синтезированных пептидов Изучение параметров стандартизации
Перед проведением биологических исследований стояла задача проведения химико-фармацевтическох исследований синтезированных пептидов. Физико-химические константы синтезированных свободных пептидов приведены в таблице 1.
Физико-химические константы синтезированных свободных пептидов
1 Н-ШБ-Пе-Тгр-ОН аморфн 0,17 0,37 0,34 -21,3
2 Н-Туг-ЬуБ-РЬе-ау-ОН аморфн 0,06 0,59 0,71 -34,5
3 Н-Туг-Туг-Рго-Зег-ИНг аморфн 0,04 0,52 0,63 0,52 -14,5
4 Н-11е-Тгр-ОН аморфн 0,55 0,88 -21,4
5 Н-Рго-Ьуэ-ОН аморфн 0,05 0,64 0,57 0,69 0,53 -5,9
6 Н-Ьуз-Ьуэ-ОН аморфн 0,07 0,72 0,49 0,54 0,43 -18,6
7 П-Ьув-СЯу-ОП аморфн 0,1 0,76 0,71 0,81 0,67 -9,3
8 Н-Авп-Туг-ОН аморфн 0,06 0,61 0,55 0,7 0,64 -16,1
9 Н-Агй-Ьуз-ОН аморфн 0,04 0,74 0,66 0,81 0,77 -27,3
10 Н-Ак-ЬуБ-ОН аморфн 0,08 0,84 0,78 0,77 0,69 -20,1
11 Н-А1а-8ег-ОН аморфн 0,12 0,88 0,75 0,81 0,71 -19,4
12 Н-А1а-Ьу5-Ьуз-ОН аморфн 0,06 0,74 0,63 0,73 0,67 -22,4
По описанию все синтезированные пептиды, кроме триптофансодержащих, являются белыми порошкообразными веществами. Триптофансодержащие пептиды являются белыми или имеют желтоватый оттенок.
Часто в качестве одного из параметров подлинности препаратов органического происхождения используют
температуру плавления. Анализ некоторых фармакопейных статей пептидных препаратов (ФСП 42-4076-08. Тимоген натрий. Субстанция; ФС 42-0001-07. Тимодепрессин. Образец стандартный; ФСП 42-0011007. Тимодепрессин, субстанция) показал, что в них температура плавления не используется как фармацевтический показатель.
В нашем случае температурный интервал плавления пептидов являлся высоким и растянутым на несколько градусов, что свидетельствовало об их аморфном характере. Кроме того, некоторые пептиды плавились с разложением. Поэтому было решено не использовать температуру плавления при стандартизации полученных пептидов.
С точки зрения применения УФ-спектрофотометрии для стандартизации пептидов по показателям подлинность и количественное содержание, полученные пептиды разделяются на две группы - пептиды, содержащие ароматические аминокислоты (Н-Шэ-Не-Тгр-ОН, Н-Туг-Ьуз-РЬе-01у-0Н, Н-Туг-Туг-Рго-Бег-КНг, Н-Ие-Тгр-ОН, Н-Авп-Туг-ОН) и пептиды - их не содержащие (Н-Рго-Ьуз-ОН, Н-Ьуз-Ьуэ-ОН, Н-Ьуз-Иу-ОН, Н-Агд-Ьув-ОН, Н-Ак-Ьув-ОН, Н-Ак-Бег-ОН, Н-А^-Ьув-Ьув-ОН). В первом случае УФ-спектрофотометрию можно использовать при их стандартизации, во втором — нет, так как составляющие их аминокислоты не обладают поглощением в УФ-области.
Анализ УФ-спектров ароматических аминокислот и содержащих их пептидов показал, что спектр поглощения пептида определяется спектром поглощения входящей в состав пептида ароматической аминокислоты. Для примера на рис.2 приведены УФ-спектры ароматических аминокислот триптофана и тирозина и дипептидов изолейцил-триптофан и аспарагинил-тирозин. Как видно из рис.2, максимумы поглощения аминокислот и содержащих их дипептидов отличаются на 1-2 нм, что соответствует ОФС 42-0042-07 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» (ГФ РФ XII издание) согласно которой отклонение в длинах волн максимума поглощения не должно превышать ±2 нм. Наблюдается отличие только по величине удельного показателя поглощения, который для аминокислот выше, чем для содержащих их дипептидов. Для примера в таблице 2 приведены полученные значения удельного
показателя поглощения для некоторых синтезированных дипептидов.
0.9 0.3 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 О
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 . Тгр -Н-Н<-Тгр-ОН
1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 О
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 ----Туг -Н-А5П-Туг-ОН
Рис.2. УФ-спектры: А - триптофана и дипептида изолейцил-триптофан и Б - тирозина и дипептида аспарагинил-тирозин
Величина показателя удельного поглощения для ароматических аминокислот и некоторых
Соединение р1см 111%
Триптофан 254,9 при 278±2 нм
Изолейцил-триптофана 100 при 278±2 нм
Гамма-глутамил-триптофан (ФС 42-0001-07) 142 при 279±2 нм
Тирозин 74,03 при 275±2 нм
Аспарагинил-тирозин 45,9 при 275±2 нм
Таким образом, положение максимума поглощения на УФ-спектре и величину оптической плотности можно использовать для идентификации пептидов, содержащих ароматические
аминокислоты, а по величине оптической плотности при одинаковой процентной концентрации веществ, можно отличить аминокислоты от пептидов. Также по величине оптической плотности можно проводить количественное определение пептидов.
При идентификации и определении подлинности часто используется тонкослойная хроматография. Как видно из таблицы 1, все пептиды отличаются по значениям в различных системах растворителей. Поэтому в нашем случае можно использовать тонкослойную хроматографию при определении подлинности пептидов.
Поскольку хроматографические пластинки различных производителей отличаются по своим характеристикам, необходимо использовать сравнение со стандартным образцом.
На примере полученных дипептидов изучили возможность использования их кислотно-основных свойств для их качественного определения. Для этих целей методом рН-метрического титрования определили константы кислотной диссоциации синтезированных дипептидов. Полученные значения приведены в таблице 3.
рК констант кислотной диссоциации
синтезированных дипептидов _
Дипептид рК, рК2 рК3
Н-Рго-Ьув-ОН 2,24 9,2 10,63
Н-Ьуз-Ьуэ-ОН 2,17 9,17 10,67
Н-ЬуБ-ОІу-ОН 2,38 9,21 10,59
Н-АІа-Ьуз-ОН 2,27 9,19 10,71
Н-Аэл-Туг-ОН 2,02 10,28
Н-Агё-Ьув-ОН 2,21 10,53
Н-А1а-8ег-ОН 2,21 9,09
Н-Ие-Тгр-ОН 5,13 10,84
Н-вІу-Тф-ОН 3,21 9,08
Для примера на рис.3 приведены кривые титрования дипептида изолейцил-триптофан.
Рис.3. Кривые тирования дипептида изолейцил-триптофан 0,1 н раствором НС1 (А) и 0,1 н раствором ЫаОН (Б).
Как видно из таблицы 3, отмечаются незначительные различия в значениях рК функциональных групп пептидов. Это объясняется близостью значений рК функциональных групп аминокислот, входящих в состав пептида. Вследствие этого эти величины нельзя использовать для идентификации синтезированных дипептидов, а для характеристики пептидов можно также использовать величину рН водного раствора.
Поскольку все пептиды являются слабыми кислотами и слабыми основаниями, в растворе находятся в цвиттер-ионной форме и значения р1 находятся в пределах, допускаемых для дистиллированной воды (5,0-6,8), а при использовании пептидов в виде растворов для инъекций концентрация в большинстве случаев составляет менее 0,1%, влияние диссоциации функциональных групп пептидов на рН воды является минимальным, в качестве одного из параметров стандартизации можно использовать значение рН водного раствора. В нашем случае при концентрации пептидов 0,01% оно находилось в пределах 5,5-6,8.
Таким образом, проведенное химико-фармацевтическое исследование синтезированных пептидов позволило выбрать показатели описание, поглощение в УФ-области, значение при использовании ТСХ и рН водного раствора как базовые для стандартизации пептидов при использовании их в качестве лекарственных препаратов.
Изучение реакций разложения
Еще одним важным аспектом фармацевтических исследований является изучение их стабильности. По мнению многих авторов (Aboofazeli R., 2003; Ezzat К. et al., 2012; Jorgensen L. et al., 2009; Ruzza P., 2010) пептидные препараты отличаются от обычных большим количеством реакций, приводящих к разложению пептида и, как следствие этого, потере биологической активности. К таким реакциям относятся окисление, гидролиз, деамидирование, р-элиминация, рацемизация и реакция дисульфидного обмена.
Деамидированию подвергаются остатки аспарагина и глутамина, спонтанной фрагментации - аспарагин-содержащие пептиды, наиболее чувствительными к металл-катализируемому окислению, являются His, Arg, Lys, Pro, Met, и Cys, к фотоокислению - His, Trp, Met, и Cys, аминокислотами, наиболее часто подвергающимися реакциям Р-элиминации, являются Cys, Ser, Thr, Phe и Lys (Frokjaer S., Hovgaard L., 2000).
Вследствие вышеизложенного перед разработкой фармацевтической композиции был проведен анализ синтезированных пептидов с точки зрения возможного протекания реакций разложения. В таблице 4 приведены возможные реакции разложения, в которых могут участвовать синтезированные пептиды.
Наименее подверженным различным превращениям является дипептид H-Pro-Lys-OH по следующим причинам: во-первых, остаток пролина находится в первом положении, что не допускает разрушения этого дипептида через образование дикетопиперазинов (этой реакции подвергаются остатки пролина, находящиеся во втором положении от N-конца цепи, во-вторых, остаток лизина, находясь во втором положении, не может вступать в реакцию Р-элиминирования, поскольку отсутствует третья аминокислота, а прохождение этой реакции по пептидной связи исключено вследствие того, что N-концевым остатком является пролин, в-третьих, в составе дипептида отсутствуют аминокислоты, способные подвергаться реакциям окисления.
Возможные реакции разложения с участием синтезированных пептидов_
Пептид Реакции разложения
Н-Ие-Тгр-ОН металл-катализируемое окисление, фотоокисление
Н-ШБ-Ие-Тгр-ОН металл-катализируемое окисление, фотоокисление
Н-А^-Ьув-ОН металл-катализируемое окисление, Р-элиминирование
Н-Туг-Ьуз-РЬе-^у-ОН металл-катализируемое окисление, фотоокисление
Н-Тут-Туг-Рго- Б ег-МН2 металл-катализируемое окисление, фотоокисление
Результатом реакций Р-элиминирования может являться рацемизация пептида, которую можно оценить по потере им оптической активности или образование на месте аминокислоты, вступившей в эту реакцию остатка дегидроаланина и выхода в раствор остатка боковой функциональной группы в случае других аминокислот, что можно обнаружить с помощью хроматографических методов. Поскольку реакция Р-элиминирования начинается с атаки а-углеродного атома гидроксид-ионом, то снижение количества последних путем поддержания рН в пределах 5-7 максимально снизит возможность протекания этой реакции. Поэтому для изучения возможного протекания реакций разложения в синтезированных пептидах использовали водные растворы.
Пептиды содержащие аминокислоты, чувствительные к процессам окисления, Н-11е-Тгр-ОН, Н-Шэ-Пе-Тгр-ОН, Н-Туг-Ьуз-РЬе-С1у-ОН, Н-Туг-Туг-Рго-Зег-ЫНг, могут вступать в реакции окисления. Поскольку металл-катализируемое окисление протекает при наличии в растворе ионов переходных металлов, то растворение пептидов в воде для инъекций исключит
возможность протекания этих реакций. Реакции фотоокисления происходят только после поглощения молекулой пептида кванта энергии. Все пептиды и белки поглощают только в УФ-области. Поэтому предохраняя водные растворы пептидов от УФ-облучения можно свести к минимуму возможность протекания реакций фотоокисления. Продукты фотоокисления можно определить в растворе по изменению УФ-спектра пептида. Например, остаток триптофана при фотоокислении переходит в кинуренин (Frokjaer S., Hovgaard L., 2000), максимумы поглощения которого находятся при 230 нм (е = 18900), 257 нм (s = 7500) и 360 нм (е = 4500) и отличаются от максимумов поглощения триптофана (при 218 нм (е = 33500), 278 нм (в = 5550) и 287,5 нм (е = 4550)) (Досон Р. И др., 1991). Остаток тирозина поглощает при 295 нм (s = 4160) в 0,04 М НС1, при 227 нм (е = 48560) и 325 нм (е = 6210) в разбавленном NaOH (Досон Р. И др., 1991).
При изучении возможности протекания побочных реакций 0,01 М растворы пептидов в воде для инъекций хранили при 25 °С и 80°С в стеклянных герметически закрытых флаконах в течение 10 суток. Через 10 суток определяли удельное оптическое вращение пептидов и снимали их УФ-спектры. Результаты исследования приведены в таблице 5.
Таким образом, пептиды в водных растворах при хранении в стеклянных флаконах практически не подвергаются реакциям Р-элиминирования и фотоокисления. Исключение составили глицин- и серинсодержащие дипептиды. Предложить объяснение этого факта можно исходя из закономерности, обнаруженной (Patel К., Borchardt R.T., 1990; Stephenson R.C, Clarke S., 1989) для реакции деамидирования аспарагинсодержащих пептидов. При определение скорости деамидирования серий Val-Tyr-Pro-Asn-Z-Ala, в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4) при 37°С было показано следующее: период полуреакции при Z=Gly составил 1.5 дня, при Z=Ser - 6.8 дней, при Z=Ala - 20.2 дней, при Z=Leu - 70 дней и при Z=Val - 106 дней. Увеличение пространственного объема С-концевого остатка у Asn понижает скорость деамидирования. Вероятно, и в нашем случае, это связано с тем, что вторые аминокислотные остатки не содержат объемных боковых радикалов, не создающих стерических затруднений для атаки гидроксил-ионом.
Изменение физико-химических характеристик пептидов при хранении при различных температурах