Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему: ПЦР-анализ слизистой оболочки полости рта при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки в условиях инфицирования Helicobacter pylori
Автореферат диссертации по медицине на тему ПЦР-анализ слизистой оболочки полости рта при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки в условиях инфицирования Helicobacter pylori
¿Iff tJ : ¿ö fit twJ:. tiwr.
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ
На правах рукописи
БИБИК Максим Владимирович
ПЦР-АНАЛИЗ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА ПРИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ В УСЛОВИЯХ ИНФИЦИРОВАНИЯ HELICOBACTER PYLORI
14.00.16 — патологическая физиология 14.00.21 — стоматология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск) и в Дальневосточном государственном медицинском университете МЗ РФ (Хабаровск)
Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Г.И. ОСКОЛЬСКИЙ
Доктор медицинских наук, профессор Т.М. СУХАРЕВСКАЯ Доктор медицинских наук Ю.М. КРИНИЦЫНА
Новосибирская государственная медицинская академия МЗ РФ
Защита диссертации состоится "_"_ 1999 г.
в_часов на заседании Диссертационного совета
Д 001.40.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (3832) 32-31-56, факс 8 (3832) 33-48-45.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН.
Автореферат диссертации разослан "_"_1999 г.
Диссертационного совета Д 001.40.01 доктор биологических наук,
профессор ЕЛ. ЛУШНИКОВА
РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА _2000 _
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Язвенная болезнь относится к наиболее распространенным заболеваниям, поражающим в большей степени лиц трудоспособного возраста, сопровождается часто тяжелыми осложнениями и ранней инвали-дизацией, что обосновывает необходимость дальнейшего изучения этиопатогенеза этого заболевания и поиск более эффективных способов его лечения и профилактики (Логинов A.C. и др., 1993; Аруин Л.И., 1995; Лапина Т.Л. и др., 1995; Григорьев П.Я., Яковенко Э.П., 1996; Циммерман Я.С., Зиннатуллин М.Р., 1997). Распространенность язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки колеблется, по данным разных авторов, колеблется от 6 до 16% (Аруин Л.И., 1998; Axon А.Т., 1995; Gitnick G., 1997), причем чаще поражается двенадцатиперстная кишка (Крылов A.A., 1991; Фролькис A.B., 1995).
Этиопатогенез язвенной болезни сложен и до сих пор окончательно не установлен. Большинство исследователей считают, что язвенная болезнь — заболевание мультифак-торное, в его развитии значительную роль играют наследственная предрасположенность и агрессивные экзо- и эндо-экологические факторы. Среди последних ведущую роль отводят Helicobacter pylori (Аруин Л.И., 1990), который способен колонизировать слизистые оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки и выявляется в 70-90% случаев у больных язвенной болезнью. При этом, несмотря на то, что Н. pylori, а точнее его метаболиты, способны оказывать повреждающее воздействие на эпителий слизистой оболочки верхних отделов желудочно-кишечного тракта, инициировать развитие воспалительного процесса, его потенциальная вирулентность и ульцерогенное влияние окончательно не установлены (Gitnick G., 1990; Blaser M.J., Parsonnet J., 1994).
В настоящее время считается, что желудок является ос-
новным резервуаром Н. pylori. В то же время появились исследования, в которых показано, что к одному из естественных резервуаров Н. pylori относится полость рта (Krajden S. et al., 1989; Nguyen A.M. et al., 1995; Oshowo A. et al., 1998). Эти исследования указывают на возможность орального пути заражения Н. pylori и реинфекции за счет поступления микроорганизмов из полости рта после эра-дикационной терапии. Следует отметить, что не все авторы разделяют эту точку зрения. Тем не менее выяснение всех возможных естественных резервуаров Н. pylori в организме человека имеет большое теоретическое и практическое значение.
Успешное разрешение этой задачи невозможно без использования как можно более специфичных методов детекции Н. pylori. В настоящее время существует ряд методов, позволяющих выявить Н. pylori — метод посева культуры, уреазный тест, с помощью которого можно идентифицировать Н. pylori в биологическом материале (биоптатах желудка, желудочном соке, слюне, содержимом зубодесневых карманов) (Рожавин М.А. и др., 1989; Зайцева К.К. и др., 1991; Маркова Г.А. и др., 1994). В последнее время широкое распространение получают методы диагностики Н. pylori с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Маркова Г.А и др., 1994; Дубинина И.Г. и др., 1997).
Использование этой технологии позволило установить корреляцию между Н. pylori инфекцией желудка и полости рта (Olsson К. et al., 1993; Banatvala N. et al., 1994; Pytko-Polonczyk J. et al., 1996). Однако многие вопросы, касающиеся колонизации слизистой оболочки полости рта Н. pylori, а также факторов, определяющих этот процесс (в частности, влияние различных конструкций протезов), остаются малоизученными.
Цель и задачи исследования. Цель работы — провести с помощью метода полимеразной цепной реакции сравнительное изучение характера инфицирования Н. pylori слизистой
оболочки полости рта и двенадцатиперстной кишки у больных язвенной болезнью.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить с применением комплекса клинических методов исследования состояние полоста рта у Н. pylori-инфици-рованных больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки без протезов;
2. Изучить с применением комплекса клинических методов исследования состояние полости рта у Н. pylori-инфици-рованных больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в различные сроки пользования несъемными протезами;
3. Изучить с помощью уреазного и ПЦР-теста Н. pylori-инфекцию полости рта у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, не пользующихся протезами;
4. Изучить с помощью биохимического и амплификаци-онного тестов состояние полости рта у больных с Н. pylori ассоциированной язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки после ортопедического лечения.
Научная новизна. Впервые с помощью быстрого уреазного теста и амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции проведен мониторинг полости рта у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori-инфекцией, до и после ортопедического лечения.
Впервые установлена корреляция между частотой инфи-цированности полости рта и двенадцатиперстной кишки аналогичными штаммами Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью в различные сроки пользования несъемными протезами.
Впервые с помощью комплексного исследования, включающего клинические, эндоскопические методы, уреазный тест и ПЦР, выявлена взаимосвязь между состоянием полости рта, персистированием Helicobacter pylori и сроками
пользования несъемными протезами у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки.
Практическая значимость. Выявленные с помощью уре-азного теста и полимеразной цепной реакции закономерности течения Helicobacter pylori-инфекции полости рта и двенадцатиперстной кишки больных язвенной болезнью до и после ортопедического лечения составляют основу для разработки комплексных методов профилактики реинфекции желудочно-кишечного тракта.
Результаты клинического исследования полости рта показали, что длительное пользование несъемными протезами ухудшает состояние пародонта и является благоприятным фоном для персистирования Helicobacter pylori-инфекции, способствует увеличению частоты рецидивов язвенной болезни.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции ассоциации стоматологов Хабаровского края (Хабаровск, 1998), совместном заседании кафедр терапевтической, хирургической и ортопедической стоматологии и ЦНИИЛ Дальневосточного государственного медицинского университета МЗ РФ (Хабаровск, 1998), VIII Международном симпозиуме "Новые технологии в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии" (Хабаровск, 1999), 7-м Международном симпозиуме по Российско-Японскому сотрудничеству в области медицины (Хиро-саки, 1999), межлабораторной научной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 1999).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 7 научных работах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы характеристики клинических наблюдений и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы (167 источников). Содержание
диссертации изложено на 100 стр. машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами, электофореграммами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведено комплексное клинико-стоматологическое и клинико-биохимическое обследование 130 мужчин в возрасте 20-75 лет с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Н. pylori, после проведения эрадика-ционной квадро-терапии (це-нол 120 мг 4 раза в сутки, омеп-разол 20 мг 2 раза в сутки, тетрациклин 500 мг 4 раза в сутки, метронидазол 500 мг 3 раза в сутки). За основу возрастной периодизации исследованных пациентов взята унифицированная периодизация возраста человека ВОЗ (Оскольс-кийГ.И., 1995).
Результаты обследования вносили в "Карту обследования пациента", разработанную на кафедре ортопедической стоматологии Дальневосточного государственного медицинского университета МЗ РФ, и обрабатывали вариационно-статистическим методом (Кравченко В.А., 1998). Учитывали время проживания на Дальнем Востоке, профессию, перенесенные и сопутствующие заболевания, состояние зубов, зубных рядов, пародонта, а также наличие вредных привычек (Боровский Е.В., Евстигнеева И.Л., 1987; Боровский Е.В., Пак А.Н., 1991).
Все обследованные пациенты были разделены на три группы. 1-ю группу составили 44 пациента в возрасте 25 — 45 лет без протезов. 2-я группа была представлена 40 пациентами в возрасте 35 — 60 лет, которые пользовались несъемными протезами в течение 5 лет. 3-ю группу составили 38 человек в возрасте 45 — 75 лет, пользующихся несъемными протезами более 5 лет.
Диагноз язвенной болезни двенадцатиперстной кишки устанавливали на основе клинического исследования, анам-
нестических данных и фиброгастродуоденоскопическош исследования с прицельной биопсией слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Фиброгастродуоденоскопию проводили в эндоскопическом отделении Железнодорожной больницы г. Хабаровска (научный консультант - доктор медицинских наук, профессор С.А.Алексеенко).
Методы клинического исследования. Всем больным с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки было проведено комплексное клиническое обследование полости рта.
Для оценки гигиенического состояния полости рта использовали индекс Федорова—Володкиной, определяемый по интенсивности окраски вестибулярной поверхности шести нижних фронтальных зубов раствором Шиллера—Писарева, окрашивающим зубной налет в темно-коричневый цвет. Гигиеническое состояние полости рта оценивали по пятибалльной системе (Данилевский Н.Ф. и др., 1993).
Интенсивность поражения зубов кариесом оценивали, используя индекс КПУ, определяемый по сумме кариозных, пломбированных полостей и удаленных зубов у одного обследованного (Яковлева В.И. и др., 1995). Показатели индекса позволяли судить о степени обеспеченности лечением и о потребности в ортопедической помощи.
Для оценки степени поражения пародонта применяли комплексный периодонтальный индекс (КПИ). Наличие воспалительного процесса в десне выявляли, используя пробу Шиллера—Писарева (Данилевский Н.Ф. и др., 1993).
Клинико-лабораторные методы исследования. Оценку результатов ортопедического лечения больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки проводили на основании общеклинических, рентгенологических, клинико-лаборатор-ных и инструментальных исследований.
Особое внимание обращали на причину и время потери зубов, срок пользования протезами и их конструкцию, характер привыкания к ним, оценку протезов больными и особенно замечания пациента в функциональном и эстетичес-
ком плане. Состояние опорных зубов, а также степень резорбции костной ткани оценивали на основании ортопан-томографии, которую проводили на аппарате PC-1000 (США) и радиовизиографии — на аппарате Trophy (Франция).
Статистическую обработку полученных результатов проводили на ЭВМ с использованием критерия Стьюдента; различия считали достоверными, если вероятность ошибки Р была меньше 0,05 (Лакин Г.Ф., 1980).
Методы клшшко-биохимического и молекулярно-генети-ческого исследования.
Уреазный тест. Для исследования уреазным тестом были взяты пробы слюны, содержимого зубодесневого кармана и биоптаты слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки.
Тест состоял из геля, содержащего 20 г/л мочевины, бактериального агента (0,02% азид натрия) и фенол-рота (0,05%) в качестве индикатора pH. Под действием бактериальной уреазы происходил гидролиз мочевины с образованием аммиака и углекислого газа, сдвигающих pH среды в щелочную сторону, что приводило к изменению цвета индикатора от желтого к малиновому.
После забора материала пробы слюны и содержимого периодонтальных карманов немедленно помещали в готовую стерильную среду. Косвенно о количестве жизнеспособных бактерий судили по времени изменения окраски теста. Значительной инфицированности Н. pylori (+++) полости рта соответствовало малиновое окрашивание теста в течение первого часа. В течение последующих двух часов она была умеренной (++), к концу суток - незначительной (+). Окрашивание среды в более поздние сроки считалось отрицательным результатом.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для исследования in vitro методом полимеразной цепной реакции использовали 2 мл слюны (с помощью гигроскопичных, стерильных, бумажных штифтов диаметром 0,5 мм), содержимое зубодес-
невых карманов и биоптаты слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Пробы слюны и бумажные штифты немедленно помещали в 0,5 мл питательной среды. С целью стандартизации исследования клинический материал брали утром (7-8 ч), до чистки зубов, что увеличивало скорость амплификации ДНК.
После обработки тканево-эксгракционным буфером (ТЭБ) образцы слюны и содержимое пародонтальных карманов инкубировали при 55°С в течение 2 ч, центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин для осаждения клеточных остатков. Этанолом осаждали ДНК из супернатанта.
Бактериальную ДНК из биоптата выделяли после отмывки в ТЭБ. Собранные центрифугированием клетки ресуспен-дировали в 50 мМ трис-НС1-буфере (pH 8,0) с 0,25 моль/л сахарозой, добавляли 1/5 объема лизоцима (5 мг/мл) и инкубировали 10 мин при 37°С. Затем добавляли 1/2 объема 20% SDS, инкубировали до полного лизиса при 37°С. Для осаждения клеточного дебриса вносили охлажденный 5 М NaCl (1/6 объема), инкубировали при 4°С. Белки осаждали центрифугированием. Супернатант экстагировали равным объемом смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1). Из водной фазы ДНК осаждали этанолом. Лизаты клеток готовили кипячением в течение 6 мин.
При амплификации с помощью ПЦР использовали два олигонуклеотидных праймера (затравки), участка ДНК, специфического для определенного штамма Н. pylori. Процесс амплификации протекал в три стадии: I - денатурация ДНК при 95°С; II - отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60°С) и III - последующая достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75°С. Праймеры были ориентированы таким образом, что синтез с помощью полиме-разы протекал только между ними, экспоненциально удваивая количество копий этого участка ДНК. Продолжительность одного цикла составляла не менее 3 мин.
Амплифицированную ДНК анализировали гель-электрофорезом в 1,2% агарозе после окрашивания этидиумом бромидом.
Для получения электрофереграмм ДНК, перенесенную из геля на нейлоновые фильтры, прижигали УФ-светом в течение 10 мин. После гибридизации с нуклеотидом фильтры отмывали в буферах. Экспонирование высушенных фильтров проводили в присутствии рентгеновской пленки.
Для исключения ложноотрицательного результата в каждой серии анализов присутствовал положительный контроль - образец с заведомо присутствующей матрицей для используемых праймеров - хромосомная ДНК искомого возбудителя инфекции.
Клинико-эндоскопическпе методы исследования слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. С целью уточнения клинического диагноза, а также стадии заболевания всем больным было проведено фиброгастродуоденоскопическое исследование, с прицельной биопсией луковицы двенадцатиперстной кишки у 64 больных. Одновременно биоптаты брали из антрального и фундального отделов желудка по показаниям для выяснения выраженности альтерации различных отделов желудочно-кишечного тракта при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Процедуру проводили с использованием фиброгастродуоденоскопов типа GIF—ХР 20 ("Olympus", Япония). В качестве источника света использовал CLE - 10. Исследование проводили после местной анестезии глотки аэрозольным орошением 10% раствором лидо-каина. Оценивали цвет слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, вид слизистой, характер складок и локализацию патологических изменений. Биопсию производили входящими в стандартный набор щипцами FB-21K.
Методы патоморфологического анализа. Для светооптичес-кого анализа биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, обрабатывали по стандартной методике и заливали в па-
рафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в сочетании.с реакцией Перлса, по ван Гизо-ну, ставили ШИК-реакцию.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ "Карт обследования пациента" показал, что распространенность кариеса среди обследованных мужчин с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, в возрасте 20-75 лет, составляла в среднем 86,5±0,8%. Необходимо отметить, что наиболее высоким этот показатель был у пациентов, не пользующихся протезами - в среднем 92,6±0,5% (рис. 1).
Показатель индекса Федорова-Володкиной среди обследованных пациентов с язвенной болезнью колебался от 2,31+0,07 (без протезов) до 3,55+0,07 (пользующиеся протезами), что свидетельствовало об ухудшении гигиенического состояния полости рта при пользовании несъемными протезами, особенно в течение длительного времени.
Положительное (темно-бурое) окрашивание пробы Шиллера-Писарева у пациентов 2-й и 3-й групп подтверждало наличие более выраженного воспаления в маргинальном и альвеолярном участках десны по сравнению с контрольной группой (слабоположительное окрашивание — светло-коричневое).
Анализ результатов комплексного периодонтального индекса выявил тяжелое поражение пародонта у больных, пользующихся протезами более 5 лет (5,31±0,07). Хотя у лиц 1-й и 2-й групп степень поражения порадонта оценивалась как средняя, однако у пациентов, пользующихся протезами до 5 лет, этот показатель (3,08±0,11) был достоверно выше, чем у больных без протезов (2,24±0,08) (рис. 2).
Основываясь на результатах комплексного клинического исследования полости рта больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Н. pylori мож-
100%-f 90%-r 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
□ He пользуются протезами
□ Пользуются протезами 1-5 лет
□ Пользуются протезами более 5 лет
Рис. 1. Распространенность кариеса (К), пломбированных (П) и удаленных (У) зубов у больных язвенной болезнью, ассоциированной с Helicobacter pylori.