Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Бактериофаги Morganella morganii и их применение с диагностической целью

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Бактериофаги Morganella morganii и их применение с диагностической целью

На мрпмх рукописи

Кузнецов Александр Юрьевич Бактериофаги Мог^алеПа тог^апи и их

применение с диагностической целью

16.00.03.-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Работа выполнена и Ульяновской государственной сельекомтшю)венной академии.

доктор биологичеких наук, профессор Васильев Д.А,

кандидат биологических паук, ведущий научный сотрудник Обухов И.Л.

Русалесв B.C. - доктор ветеринарных наук(ВНИИЗЖ) Середа А.Д. -доктор биологических наук (ВНИИВВиМ)

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Саратовский государственный агроуниверситет.

Защита состоится « /¿¿О Si с? 2000 года в часов на заседании диссертационного совета К 120.82.03 при Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Адрес: г. Ульяновск, бульвар Новый Венец. I.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке УГСХА.

Автореферат разослан << -/У»

асй. £-Р 2()00г. Учёный секретарь диссертационного совета.

кандидат ветеринарных наук, доцент Котин А.И

I. Ouiîuih характеристика работы

t.l. Актуальность темы.

Одной из основных причин гибели молодняка сельскохозяйственных животных являются желудочно-кишечные заболевания. В настоящее время, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что наряду с общепризнанными возбудителями инфекционной диареи новорожденных животных (энтеропатогенные эшерихии, сальмонеллы, клостридии перфрингенс) важную роль в возникновении кишечных инфекций играют и другие микроорганизмы, в частности представители семейства Enterobacteriaceae, относящиеся к роду Morganella (вид M. mor-ganii) (JI.С. Каврук, 1986, 1987, 1994; С.Н. Золотухин, 1994, 1996, 1997; C.B. Бритова, 1997).

С 1992 года ветеринарные лаборатории страны используют для выделения и идентификации морганелл схему, изложенную в «Методических указаниях по бактериологической диагностики смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактерия-ми», утвержденных ГУВ Минсельхозпрода СССР (1991). Предлагаемая в них схема основана на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации на основе изучения биохимических свойств бактерий. Общий срок бактериологического исследования патологического материала составляет 6-7 суток. Л.С. Кавруком с соавторами предложен ускоренный метод обнаружения морганелл в смешанных культурах с одновременной их серологической типизацией в реакции нейтрализации антител (РНАт) в соответствии с действующим «Наставлением по применению диагности-кумов морганеллезных эритроцитарных» (1991). Указанный метод позволяет обнаруживать морганелл, принадлежащих лишь к ограниченному числу О-серогрупп (01, 016, 026, 029, 033, 045, 049, «13»), хотя, согласно результатам исследования автора и данным наших исследований, в ре-

иродукторных животноводческих помещениях нередко встречаются патогенные штаммы моргаиелл других се рогрупп.

Fi настоящее время в ветеринарной практике для ускоренного обнаружения 'Некоторых микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней используют индикаторные бактериофаги в реакции нарастания титра фага РНФ (ДМ. Гольдфарб, ¡961; В.Я. Ганюшкин, 1988; В.М. Русалеев, 1990; Т. И. Кольпикова, И.А. Бакулов, В.М. Котляров, 1990, 1992, Хайруллин И.Н. и др., 1990).

В литературе имеются единичные работы в которых сообщается о выделении« и некоторых свойствах морганеллезных бактериофагов (W.C. Schmidt, C.D. JefTeris, 1974), Авторы выделили 7 фагов, активных в отношении морганелл, с помощью которых они типировали. 26 штаммов моргаиелл и отнесли их. к 14 подгруппам. С.Н. Золотухин, В.Я. Ганюшкин (1990, 1993,1994) выделили 6 штаммов морганеллезных фагов. Один из них, обладающий выраженной литической активностью, высокой урожайностью, относительно коротким латентным, периодом и широким диапазоном литической активности по отношению к патогенным штаммам морганелл, был использован для изготовления лечебно-профилактического препарата. И.М. Габрилович с соавторами (1998) было выделено 7 фагов М. morganii из лизогенных штаммов и.объектов внешней среды. Изученные фаги не лизировали представителей других родов энтеробактерий. Диапазон литической активности был в пределах 46,2%.

1.2. Цели и задачи исследования.

Исходя из вышеизложенного, нами была поставлена цель: разработать метод ускоренного обнаружения морганелл в объектах внешней среды, патологическом материале и кормах, а также для ускоренного типиро-вания эпизоотических штаммов морганелл.

Для выполнения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оптимизировать схему бактериологической идентификации морганелл по ферментативным тестам.

2. Изыскать бактериофаги, активные п отношении штаммов определенных серогрупп патогенных морганелл,

3. Изучить биологические свойства выделенных бактериофагов.

4. Подобрать оптимальный набор фагов для изготовления диагноста кумов.

5. Разработать метод идентификации морганелл с помощью индикаторных бактериофагов.

6. Разработать метод индикации названных бактерий в объектах внешней среды, патологическом материале с помощью РНФ.

1.3. Научная новизна.

1. Внесены изменения в схему идентификации морганелл при

целенаправленном их выделении.

2. Выделены специфичные морганеллезные бактериофаги с широким спектором действия в отношении патогенных штаммов морганелл.

3. Впервые в ветеринарной практике была раразработана и применена схема для индикации и идентификации морганелл в объектах внешней среды, патологическом материале с помощью бактериофагов.

1.4. Практическая ценность.

1. Внесенные изменения в'схему целенапрвленного выделения и идентификации морганелл позволяют сократить набор питательных сред, времени и посуды.

2. Предложен набор диагностических бактериофагов, состоящих из двух специфичных штаммов УГСХА MI7 и УГСХА М20.

3. Разработана НТД по применению диагностических морганеллезных бактериофагов для идентификации морганелл. .

4. Разработана НТД по индикации морганелл в патологическом материале объектах внешней среды, и пищевых продуктов с помощью РНФ.

L5.OcnoHHi.ic наложения диссспгацн»» выносимые на защиту:

• Методы выделения идентифнацни морганелл.

• Выделение морганеллезных бактериофагов.

• Изучение биологических свойств морганеллезных бактериофагов.

• Схема оптимальных режимов постановки РНФ.

• Схема идентификации морганелл с помощью морганелезных бактериофагов.

1.6. Апробация работы и публикация результатов исследовании.

Результаты исследований доложены на междунароной конференции в г. Москве (1998), на 3-х научных конференциях УГСХА (19971999). По результатам исследований опубликовано 6 печатных работ.

1.7. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора, литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, приложения. Иллюстрирована II таблицами. Список литературы включает 114 наименований -отечественных и зарубежных авторов.

2. Собственные исследования.

2.1 .Материалы и методы Питательные среды и реактивы. Мясопептонный бульон (МПБ), рН 7,6-7,8. мясопептонный агар (МПА) 0.75-ный, 1,5-ный, 2%, дифференциально-диагностические среды: 1'исса (с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом), с мочевиной, Кларка, Симонса, с феннлаланином, лизином, орнитшюм, серно-кислым железом, Клиглера, Кларка, МПЖ, Эндо и Плоскнрева. Парадиметиламинобензальдегид, соляная кислота, а-нафтол, калия гидроокись, вазелиновое масло, физиологический раствор (рН 7,0-7,2), генцианвиолет, карболовай фуксин Циля, раствор Люголя. Оборудование: термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3,; лупа бинокулярная МбС-9; ультратермостаты УТ-15У4,2 и КЬ-4 (Венгрия); центрифуга

лабораторная ОП-8-4,2; холодильники бытовые; колбы мерные; пипетки мерные объемом 1,0, 2,0, 5,0 смЗ; ампулы емкостью 5 см; флаконы емкостью 50, 100 смЗ; стекла предметные; стекла покровные; чашки Петри; пробирки; бактериологические стандарты мутности на 0,5 и 1 млрд, м.к.; шприцы, пинцеты, скальпели, ножницы.

Штаммы микроорганизмов. В работе было использовано 38 штаммов морганелл: международной коллекции, полученные нами из коллекций ВНИИВСГЭ, производственные штаммы эпизоотических серогруип из музея ВГИКИ и эпизоотические штаммы морганелл выделенные нами из патологического материала и от больных диареей телят и поросят, а так же из объектов внешней среды с неустановленной серогрупповой принадлежностью.

Культуры бактерий рода Citrobacter (С. diversus и С. freundii) в количестве 26 штаммов, 45 штаммов бактерий рода Escherichia (Е. coli), 36 штаммов рода Proteus (Р. vulgaris, P. mirabilis P. mixofaciens). 29 штаммов бактерий рода Pseudomonas (Ps. aeruginosa). 11 штаммов бактерии рода Klebsiella (Klebsiella pneumonia). 2 штамма Enterobacter cloace 2 штамма Listeria monocitogenes. 8 штаммов Staphylococcus aureus, 8 штаммов рода Bacillus (Bac. cereus и Bac. subtilis). Для выделения бактериофагов использовали пробы сточных вод свинарников-маточников, коровников, телятников, больниц и содержимое толстого отдела кишечника больных и павших телят и поросят.

Животные: белые мыши в количестве 90 голов. ..

Методы. Для разработки РНФ использовали фекалии телят и поросят, паренхиматозные органы и ткани павших и убитых животных, комбикорм, мясокостная мука.

Объекты внешней среды контамикировали морганеллами, концентрация которых по оптическому стандарту мутности составляла от 10 до 10 м.к. в I смЗ исследуемого материала. Материал до заражения исследовали бактериологическим методом на присутствие морганелл. Заражаю-

тую дозу дополнительно контролировали путем высева бактериологической суспензии в чашки 11етри со средой Эндо и Плоскирева. Бактсрилологическое исследование материала проводили в соответствии с действующими «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции, вызываемой патогенными эн-теробактериями», утвержденными ГУВ Минсельхозпрода СССР 12 декабря 1991 г. Выделение и изучение штаммов морганеллезных фагов проводилось по классическим методикам.

Диапазон литического действия и специфичность морганеллезных бактериофагов изучали по методу J. Gragie, А. Felix (1947), описанным В.Я. Ганюшкиным (1988) и использованным С.Н. Золотухиным (1994) при изучении морганеллезных фагов.

Все опыты ставили с числом повторностей (более 3-х), обеспечивающих получение воспроизводимых и достоверных результатов. Достоверность полученных результатов определяли по методу Стьюдента - Фишера.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Выделение морга.нелл из патологического материала от больных к заболевших телят и поросят. Для .изучения распространения моргаиелл в животноводческих хозяйствах Ульяновской области и пополнения коллекции музейных штаммов морганелл, которые мы использовали для изучения диапазона лирической активности фагов, нами были проведены бактериологические исследования патологического материала от больных и павших животных. Материал исследовали из 15 хозяйств Ульяновской области: 3-х молочнотоварных ферм и 11 свиноферм. -

В ходе наших исследований но выделению и идентификации морганелл бактериологическим методом возникла необходимость ускорить процесс биохимической идентификации выделенных культур и сократить набор диференциально-диагностических сред до минимума. Для этого мы

использовали трехсахарную питательную среду, предложенную С.Н. Золотухиным с соавт. (1998).

С помощью предлагаемой авторами среды можно на первом .этапе идентификации выявить микроорганизмы родов Proteus, Morganella, Retgerella, Providencia, Edwarsíella и отличить их от других родов энтеробак-терий.

Нами было исследовано бактериологическим методом материал от 23 трупов поросят, павших отдиареии в возрасте 2-14 суток; трех трупов телят, павших в возрасте 2-10 дней; 44 проб фекалий от больных диареей поросят; 11 проб фекалий от больных телят; 31 пробу сточных вод из свиноферм, неблагополучных по диарейным заболеваниям; 8 проб сточных вод из МТФ.

В результате проведенных исследований морганеллы были обнаружены на восьми свинофермах и двух молочко-товарных фермах. Частота выделения морганелл из патологического материала от трупов поросят была в пределах 25-100% случаев, из фекалий больных - 25-50% и из сточных вод свиноферм - 23-50% случаев.

Из фекалий телят морганеллы выделяли в пределах 33% случаев.

В результате проведенных исследований было выделено и идентифицировано 29 штаммов морганелл.

Патогенные свойства определяли у культур бактерий, относящихся к роду Morganella по совокупности изученных биолгических свойств методом внутрибрюненного введения 0,5 млрд. микробных клеток изучаемых бактерий. Для чего использовали агаровые культуры микроорганизмов суточного роста. Взвесями каждой культуры морганелл заражали по три белых мыши. Штамм считали патогенным в случае гибели двух или более мышей в течение трех суток после заражения..

В результате проведенных исследований установили, что абсолютное большинство штаммов М. morganii (27 из 29) - были патогенными, что составило 93,1%. Следует отмстить, что из патологического материала от

больных и павших животных патогенным« оказались культуры в 100% случаях. 2 культуры морганелл из 8-ми изученных (25%), выделенные из сточных вод были отнесены к R-формам и гибели мышей не вызывали.

2.2.2. Выделение и изучение биологических свойств моргаиеллезных

При выделении моргансллсзных фагов нами исследовался материал, взятый из прямой кишки у поросят-сосунов и телят, больных диареей а так ' же сточные воды из свинарников-маточников хозяйств Ульяновской области, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям поросят-сосунов.

Выделение штаммов фагов. Morganella morganii производили на индикаторных штаммах морганелл серЬгрупп: ОЗЗ (№36/82); 016; OI (К«619) и "13", 029.

Нами было выделено и селекционировано 13 расс фагов активных в отношении морганелл.

После 10-16-ти кратного пассирования на индикаторных культурах морганелл фаги УГСХА М8, УГСХА М9, УГСХА М10, УГСХА МП, УГСХА Ml 2, УГСХА М14, М16 оказались умеренными и проявили невысокую литическую активность (102 -103 ). Фаги УГСХА Ml5, УГСХА М13, УГСХА Ml 7, УГСХА M18, .УГСХА М19, УГСХА M 20 имели титр 1 10® по Грациа и 10'' по АппельмаИу. Негативные колонии диаметром 2-4 мм, прозрачные с ровными краями без вторичного роста фагорезистенгных клеток. .

У вирулентных штаммов, фагов были изучены специфичность и диапазон литической активности на 56 штаммах морганелл и 95 -ти штаммах бактерий гетерологичных родов и семейств.

Диапазон литической активности вирулентных фагов был в пределах 50-87%. 'J V . ..

Наиболее широким снсктором литической активности обладал фаг УГСХА М20 (87,5%). Наиболее узкий спектр имел штамм фага УГСХА М18 (50%).

Все фаги лизировали штаммы серогрупп 016, ОЗЗ, штамм морганелл серогруппы OI лизировали только две рассы фагов (УГСХА М13, УГСХА М17 и УГСХА М20), а культуру бактерий серогруппы "13"лизировал только и только штамм фага УГСХА М 17 (табл 1).

Диапзон литической активности фагов в отношении производственных штаммов морганелл эпизоотических серогрупп, депонированных в ВГНИИКСС вет. препаратов

Фаги № штамма и серогруппа исследуемых культур

Сери и УГС ХА 01 016 026 029 033 045 049 "13" %

М13 + 4- + + "Г - - - 62,5

М20 4- + +- + + + - 87,5

Исходя из диапазона литической активности выделенных фагов, мы. для дальнейшей работы использовали фаги штаммов УГСХА М17 и М20, так как их совместный спектр литической активности по отношению к изучаемым культурам составил 100%.

У этих фагов мы изучили литическую активность в отношении 38-ми полевых и музейных штаммов морганелл эпизоотических серогрупп и с

неустановленной серогрупповой принадлежностью. Результаты исследований отражены в таблице 2, из результатов которой видно, что оба штамма фаю» не лидировали 7 культур морганелл (18,4%) с неустановленной серогрупповой принадлежностью. Штамм УГСХА MI7 лизировал 17 культур (44,7%), а фаг М20 - 63,1%. Совместный спектр литической активности был равен 81,6%.

Изучение диапазона литической активности фагов УГСХА М17 и УГСХА М20 в отношении морганелл полевых и музейных штаммов

№ п.п. № штамма Серогруппа Результаты исследования

УГСХА Ml7 УГСХА М20

Диапазон литического действия (%) 44,7 63,1

Диапазон совместного литического действия (%) 81,6

Изучение специфичности бактериофагов проводили в отношении 45 штаммов E.coli, 26 штаммов бактерий рода Citrobacter, 39 штаммов рода Proteus, 20 штаммов Р. aeruginosa, 2 штамма Listeria, 3 штамма Enterobacter, 5 - Salmonella, 8 - Bacillus. 8 - Staphylococcus и 11 штаммов рода Klebsiella. ^Результаты исследований показали, что селекционированные нами фаги обладают строгой специфичностью - ни один из вышеперечисленных родов не лизировался изучаемыми фагами.

2.2.3. Разработка оптимальных условий постановки РНФ.

Для определения количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, были поставлены опыты с заражением, фекалий, фуража, мясо-костной муки и Паренхиматозных органов М. morganii серогруппы 029 для фага УГСХА" М20 и 016 для фага УГСХА

М17 различным числом (от 101 до I х 10* м.к./см') и без заражения с выявлением в субстратах морганелл методом РИФ.

Использовали фаги М17 и М20 в рабочем разведении разведении I О4 корпускул/см'. Высевы методом агаровых слоев производили через 6-8 часов инкубации исследуемого субстрата при температуре 37°С. Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подсчитывали число негативных колоний фага, выросших на плотной питательной среде (метод агаровых слоев) в опытной пробе и в контрольной пробе (контроль титра фага).

Результат реакции учитывают путем подсчета негативных колоний фага в опытных и контрольных чашках (табл 3)

Схема учета результатов РИФ.

Увеличение количества корпускул индикаторного фага в опытной пробе (пробирка №1 и 1к) в отношении к количеству корпускул в контроле(пробирка №3 и Зк) Запись результатов Оценка

Увеличение в 2,5 раза + Сомнительная

- « - от 3 до 5 раз + + Слабо положительная

Увеличение свыше 5 раз + + + Положительная

- « - более 10 раз + + + + Резко положительная

В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывают и вычитают из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках. Разницу сравнивали с контролем При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной культуры) реакция не учитывалась. РИФ, оцененная как сомнительная, не имела диагностического значения.

Результаты проведенной серии опытов свидетельствуют о положительной РИФ при концентрации морганелл в фекалиях, фураже и мясокостной муке 101 м.к./г и более и 10" м.к./г и более - при исследовании паренхиматозных органов.

Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

Для проведения дальнейших исследований необходимо было установить оптимальные условия, обеспечивающие наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Практическое значение настоящего исследования определялось необходимостью выяснить диапазон чувствительности реакции в зависимости от режима исследования, то есть решить вопрос о том, какой режим необходим для того, чтобы по нарастанию количества фага выявить присутствие малых концентраций бактерий в исследуемом субстрате. Опыты состояли в определении минимального количества морганелл, выявляемых с помощью РНФ при исследовании искусственно контаминированных объектов.

Опыт проводили при предварительном подращивании исследуемого материала и без него.

Исследуемый субстрат (царенхиматозные органы и фекалии) заражали минимальным количеством морганелл и заливали стерильным МПБ в соотношении 1:10. Смесь в течение 5-10 минут встряхивали и ставили в термостат при 37°С в течение 23, 4, 16 часов, затем разливали в 2 пробирки по 9 мл. Пробирка №3 содержала 9 мл МПБ. В пробирки №1 и 3 вносили по 1 мл индикаторных бактериофагов в рабочем разведении в дозе 1 мл. После добавления к материал фага смесь выдерживали в течение 8-ми часов при температуре 37°С. По окончании инкубации из каждой пробирки брали по 0,1 мл материала и вносили в пробирку с 9,9 мл МПБ. Все пробирки прогревали при 60°С в течение 30 минут и подвергали дальнейшему исследованию методом агаровых.

При исследовании материала без предварительного подращивания материал после встряхивания отстаивали в течение 10 минут и разливали в 2 пробирки по 9 мл. В пробирку №3 вносили по 9 мл стерильного МПБ. После встряхивания все пробирки помещали в термостат при 37°С на 2-16 часов. По истечению 2, 4,6,16 часов материал исследовали так же как и материал при подращивании.

Для контроля материал высевался на среды Эидо и Плоскирева для исследования бактериологическим методом. Результаты опытов отражены в таблице 4.

Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала

№ Варианты Минимальное количество Время, затраченное на

п.п. исследова- морганелл, обнаруживае- проведение исследований

ний мое с помощью (в часах)

Предвари- РНФ Бак. метод РНФ Бак. метод

о а о СГ я ы ь Г

1 2 10' 10* 105 10' 24 24 96 96

2 4 10» 10* ю5 10-' 26 26 96 96

3 6 10" ю2 и.о. 10- 28 28 н.о. 96

4 16 10' 101 и.о. н.о. 38 38 н.о. н.о.

Примечание: и.о. — не обнаружено.

Чуствигелыюсть РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом

№ Варианты Минимальное количество Время, затраченное на

п.п. исследова- морганелл, обнаруживае- проведение исследований

ний мое с помощью (в часах)

Инкубирова- РНФ Бак. метод РНФ Бак. метод

из •и •е- о о 3 XI Ь> ■е- п о я •О ы ■е- п О 3 и И фекалии о а ■о »

» м о ■В! 3 о . £ ж Е х 5 2 • а к X 3 "те а х г ■ х 2 И <з Г 3 "о Е * 2 и М П * X - £ 2 а

£ О и г. Е ге о и Е о О и ? о О ы Е о .

1 4 104 104; ю4 104. 20 20 96 96

2 6 10* 10л = 103 ю3 22 22 96 96

3 16 10- ю1-; н.о. н.о. 32 32 н.о. н.о.

4 24 : ю2 н.о. н.о. 40 40 н.о. н.о.

Примечание: и.о. - не обнаружено.

Результаты проведенных опытов по чувствительности РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала в МП Б при температуре 37°С показало преимущество предлагаемой реакции над бактериологическим методом исследования. Из результатов таблицы видно,

■по положительная РИФ была при содержании в фекалиях и паренхиматозных органах морганелл 10^ м.к./г при подращивании материала в течение 2-х и 4-х часов. При увеличении времени подращивания до 6-ти часов позволило позволило обнаружить морганеллы в концентрации 10" м..к./г. й подращивание материала в течение 16 часов позволило обнаружить морганеллы в концентрации 101 как в фекалиях, так и в паренхиматозных органах. Бактериологическим методом исследования при такой концентрации не удалось выделить культуры морганелл.

Таким образом, наиболее оптимальным временем подращивания является 16 часов, при котором хотя и увеличивается время исследования до 38 часов, но повышается чувствительность реакции. Время исследования бактериологическим методом насчитывает не менее 96-ти часов.

Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом нами проводилось при выращивания кон-таминированных фекалий и паренхиматозных органов при температуре 37°С в течение 4,6. 16 и 24 часов. Результаты исследований отражены в таблице . Из данных таблицы видно, что при контакте материала с фагом в течении 4-х часов позволяет обнаружить морганелл с помощью РНФ в концентрации 104 м.к./г. При увеличении времени до 6-ти часов чувствительность РНФ повышается до 103 м.к./г. Общее количество времени, затраченное при постановки РНФ было равно 22 часам, что на 72 часа короче, чем время затраченное на исследование бактериологическим методом.

Увеличение времени контакта до 16 и 24 часов позволило обнаружить морганелл в концентрации 103 как в фекалиях, так и в паренхиматозных органах. Бактериологическим методом в такой концентрации морганеллы выделить не удалось.

Таким образом, оптимальным временем контакта исследуемого материала с бактериофагом явилось 16 часов. Общее время на исследование составляет при этом 32 часа, тогда как бактериологическим методом исследования данное количество морганелл не было обнаружено

1. Бактериологические исследования патологического материала, проведенные на свиноводческих и молочно-товарных фермах при желудочно-кишечных заболеваниях поросят-сосунов и новорожденных телят, свидетельствуют о циркуляции в них патогенных штаммов морганелл. В результате проведенных исследований моргансллы был и обнаружены на 8 свинофермах и 2 молочно-товарных фермах.

2. Частота выделения морганелл из патологического материала от трупов поросят была в пределах 25-100% случаев, из фекалий больных - 2550% и из сточных вод свиноферм - 23-50% случаев. Из фекалий телят морганеллы выделяли в пределах 33% случаев.

3. Баткериофаги морганелл широко раснростанены в природе. Из образцов сточных вод и фекальных масс от больных диареей телят и поросят было выделено и селекционировано 13 расс фагов активных в отношении морганелл. Фаги УГСХА М8, УГСХА М9, УГСХА М10, УГСХА МП, УГСХА MI2, УГСХА М14, М16 оказались умеренными и проявили невысокую литическу.ю активность (102 -105). Фаги УГСХА Ml 5, УГСХА М13, УГСХАMI7, УГСХА М18, УГСХА MI9, УГСХА М 20 имели титр 2,3-8,2x109 фаговых корпускул в Л мл по Грациа и 10" по Аппельману.

4. Селекционированные штаммы' фагов УГСХА М17 и УГСХА М20 имели наибольший совместный- спектр литической активности по отношению к штаммам морганелл эпизоотических серогрупп. Диапазон совместного действия этих двух фагов на штаммы эпизоотических серогрупп и на патогенные штаммы с неустановленной серогрупповой принадлежностью составил 81,6%.

5. Изучение специфичности фагов УГСХА Ml7 и УГСХА М20 к 45 штаммам рода Escherichia, 37 штаммам рода Proteus, 27 штаммам рода Citrobacter. 19 штаммам рода Pseudomonas, 12 штаммам рода Klebsiella, 8

штаммам рода Staphylococcus, 8 штаммам рода liacillus, 2 шаммам рода Bncterobactcr и 2 штаммам рода Listeria показало на выраженную их специфичность. Оба фага не лидировали ни один из изучаемых штаммов гетерологичных родов и семейств.

Результаты проведенной серии опытов свидетельствуют о положительной РНФ при концентрации морганелл в фекалиях, фураже и мясокостной муке I О"1 м.к./r и более и Ю3 м.к./г и более - при исследовании паренхиматозных органов.

Результаты проведенных опытов по изучению чувствительности РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала в МП Б при температуре 37°С показало преимущество предлагаемой реакции над бактериологическим методом исследования. РНФ была положительной при содержании в фекалиях и паренхиматозных органах морганелл 10'1 м.к./г при подращивании материала в течение 2-х и 4-х часов. При увеличении времени подращивания до 6-ти часов позволило позволило обнаружить морганелльг в концентрации 102м..к./г. и подращивание материала в течение 16 часов позволило обнаружить морганеллы в концентрации 101 как в фекалиях, так и в паренхиматозных органах. Бактериологическим методом исследования при такой концентрации не удалось выделить культуры , морганелл.

Изучение чувствительности РНФ в зависимости от времени . ' инкубирования исследуемого материала с фагом показало, что при контакте материала с фагом в течении 4-х часов позволяет обнаружить морганелл с помощью РНФ в концентрации 104 м.к./г. При увеличении времени до 6-ти часов чувствительность РНФ повышается до 10' м.к./г. Общее количество времени, затраченное при постановки РНФ было равно 22 часам, что на 72 часа короче, чем время затраченное на исследование бактериологическим методом. Увеличение времени контакта до 16 и 24 часов позволило обнаружить морганелл в концентрации 10: как в фекалиях, так, и в

паренхиматозных органах. Бактериологическим методом в такой концентрации морганеллы выделить не удалось. 4.Практические предложения.

1. Для целенаправленного выделения и идентификации морганелл целесообразно использовать трехсарную среду, прототипом которой явилась среда Клиглера. Применение ее позволяет сократить набор используемых питательных сред, времени и посуды.

2. Предложены два штамма активных морганеллезных бактериофагов для производства диагностических препаратов обладающих строгой специфичностью широким диапазоном логической активности.

3. Для ускоренной идентификации морганелл предложен набор диагностических морганеллезных бакгерифагов, применение которых проводят согласно «Методическим указаниям по идентификации морганелл с помощью бактерифагов», утвержденными ректором УГСХА.

4. Индикацию морганелл в патологическом материале, кормах, объектах внешней среды и пищевых продуктов необходимо проводить с помощью РНФ с применением набора индикаторных морганеллезных бактериофагов УГСХА М17 и УГСХА М20 согласно «Методическим указаниям по индикации Морганелл в патологическом материале, кормах, объектах внешней среды и пищевых продуктов с помощью РНФ», утвержденными ректором УГСХА.

5.Список работ, опубликованных па теме диссертации

I .Золотухин С.Н., Кузнецов А.Ю., Данилов О.В., Васильев Д.А.

Методы лабораторной диагнотики патогенных энтеробактерий. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных работ. Ульяновск, 1998.

2. Золотухин С.Н., Данилов О.В., Кузнецов А.Ю.. Ганюшкин В.Я., Васильев Д.А. Видовой состав и биологические свойства энтеробактерий, выделенных из фекалий больных диареей поросят на свиноферме Учхоза

УГСХА. Сборник научных работ. Часть II. Инфскеционная и неинфекционная патология. Ульяновск, 1999.

3. Золотухин С.Н., Кузнецов А.Ю., Васильев Д.А., Каврук J1.C. Выделения бактериофагов рода Morganella. Проблемы инфекционных и инвазионных болезней на современном этапе в животноводстве. Москва, 1999. Золотухин С.Н., Кузнецов А.Ю., Васильев Д.А. Распространение фагов морганелл в объектах внешней среды. Вопросы микробиологии, эпи-зооотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 2000. Золотухин С.Н., Кузнецов А.Ю., Васильев Д.А., Каврук Л.С. Разработка режимов выделения бактериофагов рода Morganella. Вопросы микробиологии, эпизооотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 2000.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎