Клиническая фармакология Тимогена®. Глава 3

Дипептид L-глутамил-L-триптофан известен с середины 60-х годов прошлого века. Он оказался интересен в качестве субстрата аминопептидазы W (Gee, Kenny, 1987), причем с его использованием разработан метод флюорометрического анализа этого почечного фермента (Jacson et al., 1988). Благодаря собственной флюоресценции триптофана дипептид использовали при изучении взаимодействия триптофан-содержащих пептидов с нуклеиновыми кислотами (Szekerke, Erchegyi, 1975, 1980) и в некоторых других исследованиях (Chen et al., 1991; McDonald, O’Brien, 1972; Szekerke, Erchegyi,1975).

В 1988 г В.Х.Хавинсон с сотрудниками опубликовали сообщение о выделении индивидуального иммуноактивного компонента препаратов тимуса и назвали его Тимогеном®. Выделенное вещество оказалось дипептидом, состоящим из глутаминовой кислоты и триптофана, и имело последовательность L-глутамил-L-триптофан.

В дальнейшем это соединение было получено химическим путем (Морозов и др., 1990). На основе индивидуального синтетического пептида был создан препарат, обладающий иммуномодулирующим действием, для лечения больных с иммунодефицитными состояниями (Морозов и др., 2000; Яковлев и др., 1990). В настоящее время на основе этого дипептида выпускается препарат с торговым названием Тимоген®. Пептид входит также в состав препарата Цитовир-3®.

Структурная формула L-глутамил-L-триптофана приведена на рис.3.1. Дипептид представляет собой белый кристаллический порошок. Он мало растворим в воде, изотоническом растворе и 95%-ном спирте, практически не растворим в эфире и хлороформе.

Пептид имеет температуру плавления 205-207оС и удельное оптическое вращение [a] 20

+16.3о (с 1, 0.25н NaOH). Благодаря тому, что в молекуле L-глутамил-L-триптофана имеется одна аминогруппа и две карбоксильные группы, раствор свободного пептида (0.01% в воде) имеет рН 3.5. В УФ-спектре этого соединения имеется полоса поглощения, характерная для индольного кольца триптофана с lmax (280±0.2) нм и плечо с lmax (285±0.2) нм. L-глутамил-L-триптофан малорастворим в воде, поэтому получение водного раствора дипептида требует специальных приемов, таких как использование ультразвука для ускорения процесса растворения. В кислой среде водные растворы препарата нестабильны; при рН раствора ниже 5.0 N-концевая глутаминовая кислота быстро превращается в пироглутаминовую кислоту, образуя L-пироглутамил-L-триптофан:

При повышении концентрации водородных ионов стабильность раствора резко возрастает. Так при рН 7.0¸7.5 после двух лет хранения при +4оС в неизменном виде остается более 95% L-глутамил-L-триптофана. Следует особо подчеркнуть, что при указанных значениях рН даже при комнатной температуре (18-23оС) через 8 лет сохраняется более 60% пептида в неизменном виде. Некоторые анионы, например, ацетат-анион, введенный в состав буферного раствора, даже при рН 7.0¸7.5 способствует превращению пептида пироглутаматное соединение

Раствор Тимоген® для интраназального применения имеет рН 7.0¸7.5, при этом пептид в растворе находится в виде натриевой соли. Исследования показали, что по своим биологическим и фармакологическим свойствам она не отличается от свободного пептида. Мононатриевая соль L-глутамил-L-триптофана индивидуальна по данным ТСХ и ВЭЖХ и идентична в условиях проведения хроматографии L-глутамил-L-триптофану. Она имеет удельное оптическое вращение и УФ-спектр идентичные таковым L-глутамил- L-триптофана. В спектре протонного магнитного резонанса в D2O наблюдаются сигналы глутаминовой кислоты (d, м.д.): 1.82 м (2Н); 2.10 м (2Н); 4.42 м (1Н); сигналы триптофана (d, м.д.): 3.14 м (2Н); 3.61 м (1Н); 6.98-7.11 м (3Н); 7.33 д (1Н); 7.56 д (1 Н).

Сведения о синтезе глутамил-триптофана очень ограничены. Как правило, отмечают, что пептид получен известными методами пептидной химии (Iyo et al., 1991; Ueda et al., 1988). В то же время имеется две публикации, в которых приведены оригинальные методики пептидного синтеза дипептида (Ерюхина, Куликов, 1995; Ряховский и др., 1999). А.П. Ерюхиной и С.В Куликовым (1995) синтез проведен с использованием защитных групп, удаляемых гидрированием по следующей схеме:

В этой работе была сделана попытка оптимизации отдельных синтетических стадий. Например, был разработан приемлемый способ получения препаративных количеств L-g-бензилглутамата (II), а также g-бензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты (III). Защищенный дипептид (V) получали методом активированных N-гидроксисукцинимидных эфиров с высоким выходом.

Для получения мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана была разработана методика гидрирования с использованием донора водорода, в качестве которого использовали формиат аммония. Данная методика позволяет проводить процесс компактно без использования водорода и получать в результате непосредственно мононатриевую соль L-глутамил-L-триптофана с высоким выходом. Вещество охарактеризовано данными ТСХ и спектром протонного магнитного резонанса в D2O. Полученную соль превращали в свободный дипептид L-глутамил-L-триптофан подкислением раствора мононатриевой соли

(VI) до рН 3.5. Выход дипептида составлял 75-76%, т.пл.205-207оС, [a]20 +16.3 (с 1, 0.25н NaOH). Брутто-формула подтверждена элементным анализом. Общий выход мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана составил 37%, по глутаминовой кислоте или 90%, по g-бензиловому эфиру N-бензилоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты (III).

В.В.Ряховским и соавторами (1999) приведен в целом аналогичный путь синтеза соединения (VI) исходя из защищенной глутаминовой кислоты (III). Отличием было использование в качестве активированного эфира – пентахлорфенилового эфира. Защищенный дипептид выделяли в виде натриевой соли, а гидрировали его водородом. Общий выход по приведенной ниже схеме составил около 54% в расчете на соединение (III):

Рассмотренные схемы получения целевого пептида многостадийны. Получение ключевых соединений: защищенной глутаминовой кислоты и активированных эфиров и связано с рядом трудностей синтетического характера (Ерюхина, Куликов, 1995), что приводит к усложнению процесса. Кроме того, высокая стоимость реагентов, например, дициклогексилкарбодиимида, приводит к удорожанию целевого пептида.

Нетехнологичность лабораторных способов получения мононатриевой соли L- глутамил-L-триптофана, а также высокая стоимость используемых в процессе реагентов послужили основанием для разработки нового способа получения пептида (VI) (Куликов и др. 20000):

На базе предложенной схемы был создан дешевый технологический процесс синтеза дипептида практически в любом масштабе. Общий выход продукта составляет 56-67%, а чистота по данным ВЭЖХ>98%. После дополнительной однократной перекристаллизации чистота пептида превышает 99%.

Дипептид L-глутамил-L-триптофан, как и другие пептиды, состоящие из левовращающих изомеров аминокислот, относится к числу малотоксичных соединений. Это вполне понятно, поскольку именно из этих оптически изомеров аминокислот состоит большинство животных и растительных белков, используемых человеком в виде продуктов питания. В процессе подготовки препарата к регистрации в качестве лекарственного средства были проведены необходимые исследования острой и хронической токсичности Тимоген®. Параметры острой токсичности определяли в экспериментах на беспородных белых мышах, морских свинках и собаках. Мышам препарат вводили однократно внутримышечно в дозах 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 и 10,0 мг/кг массы тела. За животными наблюдали в течение 15 суток (табл. 3.1). За животными наблюдали в течение 15 суток. Как видно из таблицы летальных эффектов при введении препарата в дозах до 10,0 мг/кг ни у мышей не у крыс не наблюдалось.

Доза тимогена, мг/кг

В период наблюдений не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных. При аутопсии не выявлено никаких патологических изменений в месте введения. Шерсть у животных была гладкой, блестящей. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Передние и задние конечности не имели никаких патологических изменений. Органы грудной и брюшной полостей имели типичный вид, каких- либо патологических отклонений в размерах, консистенции, внешнем виде не отмечено. При гистологическом исследовании сердца, легких, печени, почек, надпочечников, головного мозга, селезенки, тимуса, костного мозга никаких патологических изменений клеточного состава и структуры клеток не выявлено.

Морским свинкам и собакам препарат вводили однократно подкожно в дозе 10 мг/кг. При последующем наблюдении в течение 4 недель никаких отклонений в состоянии здоровья, шерстного покрова или отправлениях физиологических функций выявлено не было.

При определении параметров хронической токсичности препарат вводили пяти кроликам массой 2,0 – 2,5 кг ежедневно внутримышечно в дозе 10 мг/кг в течение 30 дней. Пяти животным контрольной группы вводили аликвотное количество растворителя (изотонический раствор хлористого натрия). После окончания курса введения Тимогена® за животными наблюдали еще в течение 30 дней. На протяжении всего эксперимента 1 раз в неделю регистрировали температуру и динамику массы тела, потребление кормов, показатели сердечно-сосудистой системы и морфологические и биохимические показатели периферической крови. Температурная кривая представлена на рис. 3.2.

Рис. 3.2. Температурная кривая у кроликов в контроле и на фоне хронического введения тимогена в дозе 10 мг/кг

Длительное введение Тимогена не отражалось на динамике температурной реакции у подопытных животных. На фоне нормальной температуры животные опытной группы набирали массу тела такими же темпами, как и контрольные кролики (табл. 3.2).

Масса животных, г

При оценке состояния периферической крови не выявлено каких-либо достоверных различий между опытной и контрольной группами по содержанию гемоглобина, варьировавшему в пределах от 13,7 г/дл до 20,2 г/дл, причем в обеих группах размахи варьирования были идентичными. Не отмечено различий по числу эритроцитов (6.5·109/л 7.7·109/л); СОЭ (1,5 – 2,1 мм/ч); тромбоцитов (610·106/мл – 624·106/мл). Содержание лейкоцитов в контроле составляло (12.3±0,9)·106/л, в опыте – (13.4±0,6)·106/л. Наибольшие различия касались содержания лимфоцитов: в контроле их количество составило 60,0±1,5%, а в опытной группе – 74,1±1,9% (p<0,05). Ни у одного животного не выявлено дегенеративных изменений клеток крови (токсическая зернистость, пикноз, анизоцитоз, пойкилоцитов).

В ходе ежедневных наблюдений за животными опытной и контрольной групп внешний вид, поведенческая и двигательная активность, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек, характер физиологических отправлений, количество съеденной пищи и выпитой жидкости практически не отличались.

В состоянии сердечно-сосудистой системы после 30-дневного курса введения Тимогена® по показателям ЭКГ у животных опытной и контрольной групп не выявлено сколько-нибудь заметных изменений. Не установлено влияния Тимогена® на уровень артериального давления, частоту и глубину дыхательных движений. Отсутствовали достоверные изменения в функции печени и почек. Не установлено различий по уровню кортизола в крови опытных и контрольных животных.

При патоморфологическом исследовании не зарегистрировано каких-либо макро- и макроскопических изменений в структуре тканей и органов. Исследованные ткани имели типичное гистологическое строение без признаков дегенерации, дистрофических или некробиотических изменений. Не установлено признаков активации апоптоза.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили мнение об исключительно низкой токсичности глутамил-триптофана для половозрелых животных. Исследователям, по существу, не удалось установить величину минимальной токсической дозы препарата.

В следующей серии исследовали наличие у Тимогена® возможных тератогенных свойств. С этой целью 25 беременным самкам мышей ежедневно внутримышечно на протяжении 10 дней вводили препарат в дозах 1, 10, 20, 50 и 100 мг/кг массы в объеме 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия. На каждую дозу было взято по 20 мышей. Аналогичной по величине группе контрольных животных в течение 10 дней вводили по 0,2 мл раствора хлорида натрия.

Полученные результаты показали, что беременность у контрольных и опытных животных протекала идентично. В опытных группах животных длительность беременности составляла в среднем 21,0±1,4 дня (размах межгруппового варьирования средних: 20,5±1,2 – 21,7±1,6 дня); в контрольной группе соответствующий показатель составил: 21,8±1,4 дня (размах межгруппового варьирования средних: 20,8±1,4 – 21,4±1,6 дня). Большинство самок принесло в помете 6-7 детенышей, с массой 1,4 – 1,7 г. Каких-либо межгрупповых отличий не выявлено. Темпы постнатального развития мышат во всех группах были идентичны. Не выявлено различий в сроках открытия глаз, прорезывания резцов, образования шерстного покрова, а также динамике массы тела.

Влияние Тимогена® на эмбриогенез исследовали также и на беременных крысах. Животным опытной группы препарат вводили в дозе 10 мг/кг с 6-го по 16-й дни беременности. Крысам контрольной группы по аналогичной схеме вводили изотонический раствор хлорида натрия. На 21-е сутки животных под эфирным наркозом декапитировали, эмбрионы извлекали из полости матки, фиксировали в жидкости Буэна и окрашивали ализарином. У контрольных крыс средняя масса эмбрионов составила 2,51±0,05 г, а в опытной группе – 2,59±0,08 г. Все эмбрионы были жизнеспособными, имели нормальное развитие скелета. Между эмбрионами опытной и контрольной групп не выявлено каких-либо морфологических отличий. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии у Тимогена ® тератогенных свойств и эмбриотоксичности.

Изучение возможных мутагенных свойств Тимогена® проводили на мышах-самцах линии C57BL/6, массой 16-18 г. Тимогена® вводили однократно в дозах 0,1 мг/кг и 1 мг/кг. Кроме того, в одной группе животных Тимогена® вводили по 0,1мг/кг внутримышечно ежедневно в течение 10 дней. Животным контрольных групп вводили аликвотный объем изотонического раствора хлористого натрия. В каждой группе находилось по 5 животных.

Через 22 часа после последней инъекции Тимогена® животным всех групп внутрибрюшно вводили 0,5 мл 0,025% раствора колхицина. Через 2 часа после этого животных забивали, из большеберцовых костей выделяли костный мозг, из которого по стандартной методике выделяли клетки, фиксировали их смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты. Отмытые от фиксатора клетки наносили на предметные стекла и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Анализ кариотипа осуществляли под микроскопом (табл. 3.4). Результаты исследований показали, что Тимогена® не обладает мутагенной активностью и не влияет на частоту хромосомных аберраций в активно пролиферирующих клетках костного мозга.

Примечание. Контроль I – животным вводили изотонический раствор однократно; Контроль II – изотонический раствор животным вводили в течение 10 дней.

Непременным этапом изучения нового лекарственного препарата является оценка его аллергенности, о которой судили по результатам теста Артюса-Сахарова (Бойд, 1969). С этой целью шести кроликам обоего пола массой 2,0-2,5 кг вводили стерильно под кожу спины Тимогена® в дозе 10 мг/кг в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия с одной стороны и 1 мл лошадиной сыворотки под кожу спины с другой стороны. Кроликам контрольной группы вместо Тимогена® вводили 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Инъекции Тимогена® и лошадиной сыворотки повторяли 6 раз с интервалом 5-6 дней. На месте введения лошадиной сыворотки у кроликов обеих групп наблюдали одинаковую местную реакцию в виде гиперемии, кровоизлияний и отечности. На месте введения Тимогена ® и изотонического раствора хлорида натрия никаких реакций не выявлялось.

Продолжительное внутривенное введение Тимогена® тремя курсами по 5 дней каждый с интервалом в 7 дней не сопровождалось нарастанием титра аллергических агглютинирующих аутоантител. Таким образом, исследование препарата стандартными методами показало, что Тимогена® не аллергенен. Более того, в последующих клинических наблюдениях было установлено, что Тимогена® обладает определенными десенсибилизирующими свойствами, что позволило применять его в комплексной терапии атопических состояний.

Резюмируя результаты первого этапа доклинического исследования Тимогена ® , следует подчеркнуть, что они полностью подтвердили имевшиеся на момент проведения этих исследований предположения относительно безвредности данного дипептида.

Исследования иммуномодулирующих свойств Тимогена® показало высокое сродство дипептида с мембранными рецепторами тимоцитов. Показано, что уровень специфической фиксации Тимогена® на тимоцитах мышей достигал 14359±464 участков связывания, а доля специфических участков связывания составила 74±6% (Литвинов и др., 1992). Связавшиеся с рецепторами молекулы дипептида являются, вероятно, стартовым сигналом, запускающим каскад биоэнергетических реакций. Так, инкубация тимоцитов и лимфоцитов селезенки с Тимогена® сопровождается быстрым подъемом содержания внутриклеточного цГМФ, максимальный уровень которого регистрируется уже на 5-й мин инкубации с препаратом. В последующем концентрация циклофосфата постепенно снижалась, однако на протяжении всего периода наблюдения она оставалась выше исходного уровня (Жуков, 1991). Одновременно с повышением уровня цГМФ в тимоцитах и спленоцитах наблюдалось снижение концентрации цАМФ. Результатом этих изменений было снижение соотношения цГМФ/цАМФ (табл. 3.2).

Рис. 3.2.Влияние пептидов тимуса на коэффициент цГМФ/цАМФ в тимоцитах (1), спленоцитах (2) и клетках костного мозга (3) после 5 мин инкубации in vitro (Жуков, 1991)

В клетках костного мозга отмечены противоположные процессы. После добавления Тимогена® в культуру наблюдалось достоверное увеличение уровня цАМФ, при одновременном снижении синтеза цГМФ. Интересно отметить, что аналогичные закономерности отмечены и в культурах клеток, в которые в качестве препарата сравнения добавляли ТП-5. Эти результаты позволяют предполагать, что ответная реакция на воздействие пептидов тимуса зависит от степени дифференцировки клеток. Так, в находящиеся на ранних этапах дифференцировки лимфоцитах костного мозга пептиды тимуса вызывают активацию аденилатциклазной системы, сопровождающуюся повышением уровня цАМФ. По мере созревания клетки и изменения ее фенотипа активность аденилатциклаз снижается, а гуанилатциклаз, наоборот, повышается, в результате чего в зрелых лимфоцитах тимуса и селезенки в ответ на введение тимических пептидов увеличивается уровень цГМФ.

По данным В.Х. Хавинсона и соавторов (1988), применение Тимогена® сопровождается также достоверным увеличением активности 5-эктонуклеотидазы и аденозиндеаминазы особенно в тимоцитах высокой плотности, состоящих преимущественно из малодифференцированных кортикальных клеток, что свидетельствует о влиянии Тимогена® процессы дифференцировки лимфоцитов в тимусе. Введение тимогена крысам с иммунодепрессией, индуцированной глюкокортикоидами, сопровождается повышением синтеза белка в тимоцитах на 34% относительно контроля, синтез РНК в этих условиях возрастал на 55% (Жуков, 1991). Все эти данные свидетельствуют о том, что Тимоген® влияет на процессы дифференцировки Т-клеток, поскольку максимальные эффекты отмечены в клетках, находящихся на ранних этапах дифференцировки. Прямым доказательством этого тезиса являются результаты исследований, выполненных И.В. Мирошниченко и соавторами (1997), установившими, что инкубация предшественников Т-лимфоцитов с Тимогеном® сопровождается сменой дифференцировочных рецепторов: экспрессия антигена SC-1 сменялась экспрессией антигена Thy-1, что трактуется как превращение предшественника Т- лимфоцита в зрелую Т-клетку. Одновременно Тимоген®, как и другие пептиды тимуса, например, ТП-5, усиливал репопулирование тимуса пре-Т-клетками.

Кроме регуляции дифференцировки Т-клеток, Тимоген® обладает способностью стимулировать колониеобразующую активность клеток костного мозга в такой же степени, как и некоторые пептиды селезенки, например, Arg-Lys-Glu-Val-Tyr и Arg-Lys-Glu-Val- Tyr-Arg. При этом важно отметить, что доза Тимогена®, при которой наблюдается усиление процессов дифференцировки лимфоидных клеток и экспрессии рецепторов на лимфоцитах, в 10 – 1000 раз меньше, чем природных препаратов вилочковой железы (Яковлев и др., 1988; Морозов и др., 2000).

Тимоген® специфически фиксируется на мембране тимоцита и усиливает трансмембранный обмена Са++. Под его влиянием происходит активация систем вторичных посредников перераспределение внутриклеточного содержания цАМФ и цГМФ за счет изменения активности ферментов метаболизма циклических нуклеотидов, повышается базальная протеинкиназная активность (Демидов 1991). Правомерность последней гипотезы доказывают результаты исследования трех препаратов – тималина, тактивина и Тимогена® методом люминолзависимой люминесценции цельной крови, проточной импульсной цитофлюориметрии с применением разных флюоресцентных зондов и проточного клеточного электрофореза. Эти исследования показали, что иммуномодуляторы индуцируют изменения в хроматине лимфоцитов в виде освобождения ДНК от связей с белком (Стукова и др., 1997). Данный процесс, по существу, представляет собой переход суперспиральной ДНК в более открытую, доступную для осуществления транскрипционных процессов конформацию (Смирнов и др., 1990). В результате происходят изменения процессов репликации, транскрипции и репарации ДНК, которые индуцируют экспрессию генов. Одновременно с запуском процессов транскрипции активируются пиридиновые и флавиновые ферменты, усиливающие процессы внутриклеточного дыхания. Результатом описанных процессов является пролиферация и дифференцировка соответствующих популяций лимфоцитов. Одновременно с лимфопролиферативными процессами наблюдается повышение бактерицидной активности нейтрофилов крови, увеличивается электрофоретическая подвижность клеток крови. Происходит перераспределение лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов крови, сопровождавшееся образованием гетерогенных субпопуляций, обладающих различной функциональной активностью.

Представленные данные свидетельствуют том, что Тимоген ® не только тимомиметический иммуномодулятор, но в не меньшей степени полифункциональный биорегулятор, выполняющий, как и другие короткие пептиды, функцию стартового сигнала в пептидном регуляторном каскаде (Ашмарин, 1984; Ашмарин и др., 1986; 1989; Смирнов, 1992; Новиков, Смирнов, 1995). Эти представления позволяют понять способность Тимогена® одновременно индуцировать различные эффекты, направленность которых определяется видом клеток-мишеней и характером имеющихся повреждений.

К числу подобных эффектов в первую очередь следует отнести формирование иммунного ответа на тимусзависимый антиген, в качестве которого принято использовать эритроциты барана, отмытые изотоническим раствором хлористого натрия. Исследование проводили на мышах оппозитных линий CBA (высокореагирующая) и C57BL6 (слабореагирующая). Животным опытных групп вводили Тимоген®, или тималин (препарат сравнения) в дозах 0,0001 – 1,0 мг/кг внутримышечно в течение 7 сут. до иммунизации. Контрольным животным вместо препаратов вводили изотонический раствор хлорида натрия. Иммунизацию проводили однократно путем внутривенного введения 1·107 эритроцитов барана. На 5-е сутки в сыворотке крови определяли титры гемагглютининов, а в селезенке — количество антителобразующих клеток (табл. 3.5).