научная статья по теме Образование дипептидов - побочная реакция при рацемизации фенилаланина Химия

Текст научной статьи на тему «Образование дипептидов - побочная реакция при рацемизации фенилаланина»

ОБРАЗОВАНИЕ ДИПЕПТИДОВ - ПОБОЧНАЯ РЕАКЦИЯ ПРИ РАЦЕМИЗАЦИИ ФЕНИЛАЛАНИНА

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 113545, Москва, 1-й Дорожный пр., 1 Поступила в редакцию 14.01.99 г. Принята к печати 22.03.99 г.

Показано, что в ходе рацемизации £>-фенилаланина в присутствии уксусного ангидрида помимо Ас-/;>ХРЬе-ОН образуются ацетилированные дипептиды Ас-ОРЬе-ОРЬе-ОН, Ас-1РЬе^РЬе-ОН, Ас-/^РИе-£РЬе-ОН и Ас^РЬе-/?РЬе-ОН. Суммарное содержание дипептидов в реакционной смеси в зависимости от условий реакции составляет от 40 до 60%. Сделан вывод, что фенилаланин подобно а-аминоизомасляной кислоте склонен к полимеризации в условиях рацемизации.

Ключевые слова: фенилаланин, рацемизация; уксусный ангидрид; оксазолоны.

Оптически активные энантиомеры аминокислот находят широкое применение в здравоохранении, пищевой промышленности и животноводстве. В частности, L-фенилаланин входит в состав смесей для парентерального питания и является одним из компонентов интенсивного подсластителя - аспартама, а его D-антипод применяется как эффективный антидепрессант и анальгетик. Рацемические смеси являются исходными для получения оптически активных энантиомеров, поэтому проблема рацемизации a-аминокислот остается актуальной как в лабораторной практике, так и в промышленности.

Одним из наиболее доступных реагентов, применяемых в процессе рацемизации а-аминокис-лот, является уксусный ангидрид. Оптически активные a-аминокислоты легко превращаются в рацемические ацетильные производные при нагревании их с уксусным ангидридом при температуре около 100°С [1]. Промежуточная стадия в этом процессе - образование оксазолонов (азлак-тонов), обладающих малой оптической стабильностью [2, 3]. Однако протекающая в присутствии уксусного ангидрида рацемизация часто сопровождается образованием побочных соединений, частичной деструкцией и осмолением [4, 5].

Ранее нами была разработана технологическая схема ферментативного синтеза подсластителя - аспартама (метилового эфира L-acnapnm-L-фсиилаланина), включающая в качестве исходного сырья метиловый эфир ОХ-фенилаланина и предполагающая последующую рацемизацию не-вовлеченного в синтез производного D-фенил-аланина [6]. С этой целью был изучен процесс ра-

# Автор для переписки (тел.: (095) 315-37-38; e-mail: lab 1 l@vnigeo.msk.su).

цемизации этой аминокислоты в присутствии уксусного ангидрида и выявлены сопровождающие его побочные реакции.

При действии уксусного ангидрида на О-фени-лаланин образуется соответствующий оксазолон, который легко превращается в рацемическую а-ацетиламинокислоту гидролизом в мягких условиях (схема 1 ,а) [7]. Эта реакция протекает как в водно-щелочной, так и в безводной среде. Однако, поскольку рацемизация в водных растворах сопряжена с повышенным расходом уксусного ангидрида из-за его гидролиза, происходящего с большой скоростью при высоких значениях рН [8], наиболее целесообразным нам представлялось проведение этого процесса в безводной среде в присутствии уксусной кислоты либо уксусного ангидрида в качестве растворителя (таблица).

Следует отметить, что, в связи с прикладным характером поставленной задачи, необходимо было подобрать условия рацемизации с наименьшим расходом используемых реагентов. В литературе описывается рацемизация производных а-аминокислот в присутствии каталитического количества уксусного ангидрида (0.1-2% по весу), протекающая в расплаве в вакууме или в атмосфере инертного газа при температуре 170-200°С [5, 9]. Этот способ представляется перспективным в случае //-ациламинокислот, но он вряд ли пригоден для свободных аминокислот из-за их высокой температуры плавления, сопровождаемого разложением (например, температура плавления Д£-фенилаланина 271-273°С).

Есть сведения, что в присутствии эквимольно-го количества уксусного ангидрида О-фенилала-нин не теряет оптической активности [1]. Однако в нашем случае в таких условиях наблюдалась его

NH2CHCOOH (СН3С0)20 , JJ- ПЬСП. нр^ CH3CONHCHCOOH

СН3-\о/^0 (я) ' сн2с6н5

СН2С(,Н5 СН2С6Н, (СН3С0)20

CH3CONHCH л J= о I о СН2С6Н5

CHnCfjH^ СН ¡0,11 s СН0С5Н5

частичная рацемизация (таблица). Использование полутора к ратного избытка уксусного ангидрида приводило к возрастанию степени оптической изомеризации от 64 до 75%, а увеличение продолжительности реакции в 2 раза обеспечивало полную рацемизацию. Дальнейшее повышение избытка уксусного ангидрида до соотношения 5.2 : I позволило сократить время реакции с 2 К 5 ч при сохранении количественной степени рацемизации.

Отметим, что использование в качестве растворителя 14 эквивалентов уксусной кислоты (в расчете на £>-фенилаланин) несколько снижает расход уксусного ангидрида (с 1.73 до 1.5 эквивалента). Однако этот способ кажется нам менее перспективным в связи с последующей необходимостью утилизации большого объема растворителя.

Наиболее удобными условиями крупномасштабного процесса рацемизации, с нашей точки фения, являются 95°С и 5-кратный избыток уксусного ангидрида. Однако при ВЭЖХ-анализе состава полученного в таких условиях рацемата нар<шу с Лс-ОХРЬе-ОН были обнаружены два по-5. шых продукта (рис. 1). Суммарное содержание этих продуктов в выделенном рацемате в зависи-Мкп от условий реакции составляло 40-60%. П( скольку в литературе часто указывается на со-

провождающие рацемизацию побочные реакции и деструкцию [4, 5], а сведения об идентификации побочных продуктов весьма ограничены, мы решили исследовать это явление более подробно.

Известно [7], что некоторые а-ациламинокис-лоты под действием уксусного ангидрида превращаются в нейтральные вещества - диацилдикето-пиперазины. Кроме того, промежуточные окса-золоны имеют тенденцию полимеризоваться, по-

Рацемизация £>-фенилаланина в присутствии уксусного ангидрида

Соотношение реагентов ОРЬе: Ас20, моль/моль Условия i .20 La]0 , (el, метанол), град* Степень рацемизации, %

1 : 1.0 1 ч, 110—120°С -14.65 64

1 : 1.5 1 ч,110-120°С -9.85 75

1 : 1.73 1 ч,110-120°С -0.15. -0.17 колич.

1 : 1.5 2 ч, 100°С, 5 мл А сОН/1 г -0.15. -0.17 колич.

1 : 2.6 1 ч, 110—120°С -0.16. -0.18 колич.

1 : 5.2 0.5 ч, 93-97°С -0.11. -0.13 колич.

* Для Ac-DPhe [a]7,° -40°.

Рис. I. Профиль ВЭЖХ выделенного рацемата: Ас-РХРЬе-ОН (/), Ас-ОРЬе-ОРИе-ОН и Ас-^РИе-^РЬе-ОН (2); Ас-ОРЬе-те-ОИ и Ас-Шк-ОРЬе-ОН (5). (Условия получения рацемата см. последнюю строку таблицы.)

видимому, путем ацилирования одной молекулы оксазолона другой с последующей перегруппировкой, приводящей к образованию пирролиди-нового кольца [7] (схема 2).

Однако эти превращения в данном случае маловероятны, поскольку кислотный гидролиз суммарного рацемата приводит к количественному появлению фенилаланина, что указывает на отсутствие каких-либо структурных превращений этого аминокислотного остатка.

В ряде случаев обработка аминокислот уксусным ангидридом может сопровождаться образованием димерных или даже полимерных продуктов [7]. Такая полимеризация возможна благодаря способности 5(4)-оксазолона реагировать с первичными аминами с образованием соответст-

вующих амидов. Результат обработки конкретной аминокислоты зависит от соотношения скоростей ее реакции с оксазолоном пли уксусным ангидридом. Так, а-аминоизомасляная кислота образует оксазолон с выходом 20% с последующей полимеризацией [7].

Мы предположили, что и в нашем случае образование побочных продуктов происходит по механизму, аналогичному процессу полимеризации а-аминоизомасляной кислоты [7] (схема 1, б). Образующийся на первом этапе оксазолон реагирует с молекулой £>-фенилаланина с образованием дипептида. Последующие реакции димера с уксусным ангидридом и аминокислотой могут привести к появлению трипептида и других полимерных продуктов.

Для подтверждения этого предположения мы выделили побочные вещества (2) и (3) рис. 1 в индивидуальном виде, что удалось сделать благодаря существенной разнице в их растворимости. Вещество (2), в отличие от ацетил-О,¿-фенилаланина (1) и вещества (3), практически не растворялось в ацетонитрилеи метаноле.

Вы,деленные вещества (2) и (3) оказались оптически неактивными, а их ЯМР- и масс-спектры (рис. 2) были практически идентичны и соответствовали ацетилированному дииептиду Ас-РЬе-РЬе-ОН (А/,. 354). Следовательно, в процессе рацемизации фенилаланина в присутствии уксусного ангидрида образуется смесь ацетилдипептидов с разнообразным набором конфигурации остатков фенилаланина ЬЬ, £>£>, ОЬ и Ы).

Различия между веществами (2) и (3), заключающиеся в их хроматографическом поведении и растворимости, можно объяснить, предположив, что одно из них представляет собой смесь двух ди-пептидов, состоящих из остатков фенилаланина только и 0,/)-конфигурации < АеХРЬе 7,Р1|е-011 и Ас-ОРЬе-УРЬс-ОН), а другое - смесь дипеп-тидов, каждый из которых содержит разновраща-ющие остатки фенилаланина (Ас-/,РЬе-/)РЬе-ОН и Ас-ОРЬе-¿РЬе-ОН).

Для доказательства этого методом ферментативной конденсации в присутствии термолизина был синтезирован дипептид Ас-ЬРИе-АРИе-ОН; по данным ВЭЖХ он полностью соответствовал веществу (2). Кроме того, карбодиимидным способом из соответствующих СЬг-произ водных с последующими гидрированием и ацетилированием было получено соединение Ас-ОРЬе^РЬе-ОН, по хроматографической подвижности совпадающее с веществом (3). Этим же способом синтезированы дипептиды Ас-ОРЬе-^ХРЬе-ОН и АсХР11е-£>ХРЬе-011. каждый из которых в условиях ВЭЖХ был представлен двумя пиками, соответствующими по времени выхода веществам (2) и (3), что полностью подтверждало наше предположение.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎