Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями Бабошин Михаил Александрович

Бабошин Михаил Александрович. Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями : диссертация . кандидата биологических наук : 03.00.07 / Бабошин Михаил Александрович; [Место защиты: Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН].- Пущино, 2007.- 99 с.: ил. РГБ ОД, 61 07-3/1270

Содержание к диссертации

1.1. Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов 9

1.2. Микроорганизмы, осуществляющие биодеградацию и биотрансформацию полиароматических углеводородов 11

1.3. Пути аэробного метаболизма полиароматических углеводородов бактериями.. 15

1.4. Условия, влияющие на биоконверсию ПАУ микроорганизмами 25

Материалы и методы

2.1. Микроорганизмы и методы их выделения 28

2.2. Культивирование штаммов, осуществляющих деградацию и трансформацию полиароматических углеводородов 30

2.3. Методы, использованные при изучении биоконверсии ПАУ 32

2.4. Методы кинетического анализа 36

3.1. Штаммы-деструкторы ПАУ, отобранные из лабораторной коллекции и выделенные из природных образцов 38

3.2. Превращение флуорена бактериями рода Rhodococcus 39

3.3. Кометаболизм флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 41

3.4. Трансформация флуоренола и флуоренона штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 45

3.5. Превращение бактериями фенантрена и антрацена 52

3.3. Деградация фенантрена штаммом Arthrobacter sp. КЗ 54

3.4. Потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacter sp. КЗ. 56

3.5. Деградация ПАУ накопительными культурами, поддерживаемыми в среде с экстрактом каменноугольного пека 62

3.6. Конверсия полиароматических соединений штаммом Sphingomonas sp. Маг-33 65

3.7. Конверсия ПАУ штаммом Mycobacterium sp. Mar-59 74

Список литературы 84

Введение к работе

Актуальность проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) образуются в неспецифических процессах деструкции различных органических веществ при высоких температурах, например, при лесных пожарах, коксовании угля. С развитием промышленности, когда к природным источникам ПАУ прибавились антропогенные (сжигание топлива, проливы нефти и каменноугольных продуктов), возникла проблема загрязнения окружающей среды этими токсичными веществами. Присутствием ПАУ в биосфере на протяжении всей истории органической эволюции нашей планеты обусловлено существование живых организмов, способных к использованию ПАУ в качестве источника энергии для жизнедеятельности. Это бактерии различной систематической принадлежности. В настоящее время ПАУ-деградирующие бактерии интенсивно изучаются в связи с разработкой технологий детоксикации промышленных отходов и биоремедиации загрязненных почв, донных осадков и грунтовых вод. Особое внимание уделяется выделению и исследованию штаммов, способных к деградации так называемых высокомолекулярных ПАУ, молекулы которых содержат больше трех ароматических колец. Высокомолекулярные ПАУ более устойчивы к биодеградации, чем ПАУ с меньшей молекулярной массой, и число известных бактерий, способных их окислять, существенно меньше. Многие высокомолекулярные ПАУ оказывают мутагенное и канцерогенное воздействие на человека и животных, в связи с чем их концентрация в окружающей среде является объектом постоянного мониторинга. Биоремедиация считается наиболее перспективным методом очистки почвы и других сред от ПАУ.

С другой стороны, многие живые организмы, осуществляют относительно "неглубокие" превращения молекул ПАУ (трансформация), часто без непосредственного использования ПАУ в качестве источника энергии для роста. Трансформация ПАУ имеет большое значение для функционирования микробных сообществ. Поскольку превращение ПАУ бактериями в большинстве случаев отличается от реакций химического окисления ПАУ, бактериальное окисление ПАУ может использоваться для получения соединений, трудно доступных химическим путем.

Таким образом, изучение бактерий-деструкторов ПАУ актуально, во-первых, с точки зрения разработки методов биоремедиации и, во-вторых, для получения веществ, труднодоступных химическим путем. Состояние проблемы. Известно, что главную роль в деградации ПАУ в загрязненных почвах играют аэробные бактерии. Среди них имеются представители десятков родов (Juhasz et Naidu, 2000). Количество выделенных штаммов и систематическое разнообразие бактерий, способных к деградации высокомолекулярных ПАУ, значительно меньше (Kanaly et Harayama, 2000). Для ряда высокомолекулярных ПАУ не известно ни одного штамма, способного к их использованию в качестве единственного источника углерода и энергии, но есть штаммы, осуществляющие деградацию данных ПАУ в соокислительных условиях. Задача выделения и исследования новых штаммов-деструкторов высокомолекулярных ПАУ является по-прежнему актуальной (Но et al, 2000; Bastiaens et al, 2000; Willison, 2004; Lopez et al, 2005). Наибольший прогресс достигнут в описании метаболических путей деградации ПАУ. Описанные ранее пути метаболизма фенантрена (Evans et al, 1965; Kiyohara et al., 1976), антрацена (Evans et al., 1965), аценафтена и аценафтилена (Schocken et Gibson, 1984), флуорена (Grifoll et al, 1994; Trenz et al, 1994; Casellas et al, 1997), флуорантена (Weissenfels et al, 1991; Kelley et al, 1993) и пирена (Heitkamp et al, 1988) впоследствии находили подтверждение при изучении других штаммов и уточнялись. Ряд модификаций ранее известных метаболических путей и альтернативные метаболические пути обнаружены относительно недавно (Rehmann et al, 2001; Story et al, 2001; Vila et al, 2001; van Herwijnen et al, 2003; Lopez et al, 2006; Keum et al, 2006; Poonthrigpun et al, 2006 и др.), это свидетельствует о том, что исследование бактериального метаболизма ПАУ еще не завершено. Другим стимулом для описания новых метаболических путей является выделение новых штаммов, способных к деградации устойчивых высокомолекулярных ПАУ, метаболизм которых прежде не изучали (Willison, 2004). Гораздо меньше известно о влиянии различных условий на конверсию ПАУ микроорганизмами. Есть данные о влиянии на скорость бактериальной деградации ПАУ следующих факторов: одновременного потребления культурой другого органического субстрата (Kanaly et al, 2002), ингибирования продуктами конверсии ПАУ (Casellas et al, 1998; Kazunga et Aitken, 2000), перекрестной индукции (Molina et al, 1999), конкурентного ингибирования другими ПАУ (Stringfellow et Aitken, 1995), ограниченной доступности ПАУ для микроорганизмов (Johnsen et al, 2005). Важным условием, влияющим на конверсию ПАУ конкретным микроорганизмом, является присутствие в экосистеме других микроорганизмов, которые могут изменять концентрации субстратов, продуктов и других веществ в среде. Исследований по конверсии ПАУ смешанными культурами известного состава выполнено мало (Casellas et al, 1998; Bouchez et al, 1999; Boonchan et al, 2000). В большинстве работ по изучению конверсии ПАУ бактериями объектом является чистая культура, растущая на среде с одним ПАУ в качестве единственного источника углерода и энергии, т.е. в условиях, резко отличающихся от условий в естественной среде (например, в почве), где наблюдается ограниченная биодоступность субстрата, наличие многих ПАУ и разнообразных микроорганизмов, нестабильность физических и химических параметров (Johnsen et al, 2005). С другой стороны, процессы в почве слишком сложны для анализа, поэтому решением проблемы могла бы стать разработка методов культивирования, лучше моделирующих естественные условия. В некоторых работах предприняты попытки кинетического анализа конверсии ПАУ бактериями (Stringfellow et Aitken, 1995; Wick et al, 2001; Lotfabad et Gray, 2002). Учитывая, что кинетические исследования необходимы для понимания механизма изучаемых процессов, такого рода работ выполнено недостаточно. Много публикаций по деградации ПАУ бактериями появилось уже во время выполнения данной работы. Были более детально описаны пути метаболизма ПАУ относительно малой молекулярной массы (Moody et al, 2001; van Herwijnen et al, 2003; Keum et al, 2006; Poonthrigpun et al, 2006), флуорантена (Rehmann et al, 2001; Story et al, 2001; Lopez et al, 2006), пирена (Vila et al, 2001) и ПАУ большей молекулярной массы (Moody et al, 2004; Moody et al, 2005). Выделен целый ряд штаммов, осуществляющих деградацию высокомолекулярных ПАУ (Rehmann et al, 2001; Vila et al, 2001; Dean-Ross et al, 2002; Bogan et al, 2003; Dandie et al, 2004; Habe et al, 2004; Sho et al, 2004; Willison, 2004; Zhang et al, 2004). Изучалась биодоступность ПАУ (Garcia-Junco et al, 2001; Kanaly et al, 2002; Wick et al, 2002; Miyata et al, 2004; Vacca et al, 2005). Проводились эксперименты по биодеградации сложных смесей ПАУ (Dean-Ross et al, 2002; Lotfabad et Gray, 2002; McLellan et al, 2002) и биоремедиации (Ramirez et al, 2001; Eriksson et al, 2003; Harper et al, 2005; Hickey et al, 2007).

Цель и задачи исследования.

Цель работы - поиск в коллекции и выделение из природных образцов штаммов бактерий, обладающих способностью к превращению широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных ПАУ), и изучение биоконверсии ПАУ данными штаммами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- отбор из лабораторной коллекции, а также выделение из загрязненных почв и донных осадков штаммов бактерий, способных к трансформации и полной деградации ПАУ;

- идентификация продуктов биоконверсии ПАУ новыми и ранее выделенными бактериальными штаммами; установление путей метаболизма ПАУ;

- качественное и количественное описание влияния различных факторов на конверсию ПАУ исследуемыми культурами;

- изучение биоконверсии интермедиатов метаболизма ПАУ.

Научная новизна работы. Выделены из природных образцов и охарактеризованы a3 новых штамма бактерий, способных к конверсии широкого спектра ПАУ: Arthrobacter sp. КЗ, способный к быстрой деградации фенантрена в высоких концентрациях; Sphingomonas sp. Mar-33, осуществляющий конверсию нафталина, фенантрена, антрацена, флуорена, аценафтена, флуорантена, пирена и бензо[а]антрацена; Mycobacterium sp. Mar-59, растущий в минеральной среде с фенантреном или пиреном, и осуществляющий конверсию ряда ПАУ в соокислительных условиях. В качестве продуктов бактериального окисления флуорена впервые идентифицированы инданонкетоуксусная кислота, 2-гидроксифлуоренон и 2,7-дигидроксифлуорен. Показано, что соотношение концентраций двух главных продуктов конверсии флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 -флуоренола и флуоренона - четко зависит от удельной скорости роста биомассы; предложено объяснение наблюдаемого эффекта. Исследовано потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacler sp. КЗ; показано, что добавление субстрата в растущую культуру вызывает лаг-фазу роста только в случае, если исходная концентрация субстрата в среде не была насыщающей. Установлено, что процессы превращения фенантрена и антрацена в 1-гидрокси-2-нафтойную и З-гидрокси-2-нафтойную кислоты соответственно культурой Sphingomonas sp. Mar-33 являются высокоселективными реакциями, и описан метод получения продуктов в препаративных количествах. Показано, что накопительные культуры, а также штамм Sphingomonas sp. Mar-33, способны осуществлять превращение широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных) при культивировании в среде с экстрактом каменноугольного пека. Практическая значимость. Выделенные штаммы могут быть использованы для биоремедиации почв и промышленных отходов нефтеперерабатывающих и коксохимических производств, загрязненных высокомолекулярными, особо устойчивыми ПАУ. Штамм Sphingomonas sp. Mar-33 представляет наибольший интерес, поскольку осуществляет деградацию широкого спектра ПАУ, в том числе в среде с экстрактом каменноугольного пека. Выделенные штаммы интересны также с точки зрения производства ценных соединений, трудно доступных химическим синтезом (например, гидроксипроизводных фенантрена, перспективных для применения в медицине). Полученные накопительные культуры, эффективные в отношении деградации высокомолекулярных ПАУ, могут быть использованы для выделения новых штаммов-деструкторов. Предложенная методика культивирования в среде с экстрактом каменноугольного пека может применяться для поддержания накопительных культур и в качестве тест-системы для исследования биоконверсии высокомолекулярных ПАУ. Разработанные методы кинетического анализа могут применяться для анализа реакций биоконверсии независимо от объекта исследования.

Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов

Молекулы полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) содержат конденсированные ароматические кольца - циклы с общими атомами углерода. Простейшим ПАУ является нафталин, молекула которого состоит из двух конденсированных ароматических колец. У соединений большей молекулярной массы наблюдается изомерия положения колец. Кольца могут соединяться линейно, под углом, либо посредством пери-сочленения, этим обусловлено наличие многочисленных изомеров (рис. 1.1). ПАУ химически весьма стабильны, исключение составляют длинные молекулы линейного строения, например, тетрацен (Клар, 1971). Летучесть большинства ПАУ очень мала. Химические и физические свойства ПАУ благоприятствуют их длительному сохранению в загрязненных почвах и донных отложениях. Растворимость ПАУ в водных растворах крайне низка (таблица 1.1). Микроорганизмы, однако, способны потреблять субстрат из столь разбавленных растворов, поскольку субстратные константы ферментов и микроорганизмов (Ks) лежат в пределах 10" . 10 моль/л (Варфоломеев, Калюжный, 1990), т.е. сопоставимы с растворимостью большинства ПАУ в воде.

ПАУ образуются при пиролизе органических веществ в различных технологических и природных процессах. В наибольшей концентрации они содержатся в каменноугольной смоле, которая и является источником ПАУ для промышленности (Химическая энциклопедия, 1990). Из-за неспецифичности реакции образования ПАУ антропогенное загрязнение окружающей среды этими веществами является весьма общей проблемой, не связанной к какой-либо одной сферой деятельности. Главный источник поступления ПАУ в окружающую среду - сжигание топлива (Freeman et Cattel, 1990). В меньших объемах ПАУ образуются при лесных пожарах и извержениях вулканов (Sutherland et al, 1995). Наиболее опасны для здоровья человека проливы каменноугольных продуктов и нефти, такие локальные загрязнения следует подвергать очистке (Mueller et al, 1989). В качестве одного из перспективных методов устранения загрязнения рассматривается биоремедиация - метод очистки, предполагающий использование деятельности живых организмов (Bamforth et Singleton, 2005). Из-за наличия многих источников поступления в окружающую среду ПАУ обнаруживаются повсеместно - в воздухе (Greenberg et al, 1985), в донных отложениях (Yongblood et Blumer, 1975), в почве (Jones et al, 1989), в растениях и животных (Juhasz et Naidu, 2000). ПАУ токсичны для животных и человека (Sutherland, 1990). Многие из них, кроме того, обладают мутагенными и канцерогенными свойствами. Дибенз[о,Л]антрацен и бензо[а]пирен были первыми веществами, для которых была экспериментально показана канцерогенная активность (Шенталь, 1971). Сильным канцерогенным действием обладают, кроме того, дибензпирены, а также синтетическое нафтеноароматическое соединение - холантрен. Целый ряд ПАУ (хризен, бензо[а]антрацен, бензо[с]фенантрен и др.) проявляют канцерогенные свойства в меньшей степени; например, хризен активен лишь при подкожном введении (Клар, 1971).

Сопоставление скорости конверсии ПАУ в образцах загрязненной почвы и донных осадков со скоростью конверсии в стерильных контролях указывает на то, что деятельность микрофлоры играет главную роль в ремедиации территорий и акваторий, загрязненных полиароматическими углеводородами (Sutherland et al, 1995; Eriksson et al, 2003). Различные ПАУ подвержены биоконверсии в разной степени. Устойчивость ПАУ возрастает с увеличением молекулярной массы (Bossert et Bartha, 1986). ПАУ, молекула которых содержит более трех ароматических колец, проявляют повышенную устойчивость к биодеградации, в связи с чем их рассматривают отдельно, называя высокомолекулярными ПАУ (Kanaly et Harayama, 2000). Другие авторы (Johnsen et al, 2005) к высокомолекулярным относят ПАУ, содержащие 5-7 ароматических колец. Проблеме биодеградации высокомолекулярных ПАУ в последнее время уделяется особое внимание (Kanaly et Harayama, 2000; Juhasz et Naidu, 2000).

В аэробных условиях скорость конверсии ПАУ выше, а спектр ПАУ, подвергающихся конверсии, шире, чем в анаэробных условиях (Mihelcic et Luthy, 1988; Eriksson et al, 2003). Тем не менее, доказано, что ПАУ могут подвергаться биодеградации в условиях нитратредукции (McNally et al, 1998; Rockne et al., 2000) и сульфатредукции (Bedessem et al, 1997; Coates et al, 1997). Выделены штаммы, потребляющие нафталин, восстанавливая нитрат до нитрита (Rockne et al, 2000). Обнаружено микробное сообщество, осуществляющее анаэробную сульфат-зависимую минерализацию нафталина, фенантрена, флуорена и флуорантена (Coates et al, 1997).

К превращению. ПАУ способны самые разные живые организмы (бактерии, грибы, водоросли, животные), но, по-видимому, только некоторые бактерии осуществляют конверсию ПАУ с целью последующей ассимиляции образующихся продуктов. Смысл гидроксилирования ПАУ грибами и млекопитающими заключается, вероятно, в детоксикации (Cerniglia, 1984). Окисление ПАУ может быть также побочным эффектом работы мощных окислительных систем (например, лигнин-пероксидаз), предназначенных для другой цели (Casellas et al, 1998).

Пути аэробного метаболизма полиароматических углеводородов бактериями..

Проникновение малых неполярных молекул ПАУ в клетку происходит путем пассивной диффузии и не требует специальных транспорных систем (Bateman et al, 1986). При переносе генов, кодирующих нафталин-диоксигеназу Pseudomonas sp. strain NCIB 9816, в E. coli полученный штамм-трансформант быстро окисляет нафталин, фенантрен и другие ПАУ, не нуждаясь в каких-либо особых генах для переноса субстрата через клеточную стенку (Resnick et al, 1996а; Parales et al, 2000). Тем не менее, в ряде работ выдвигаются аргументы в пользу существования систем активного транспорта ПАУ в бактериальную клетку (Whitman et al, 1998; Miyata et al, 2004).

Ниже рассмотрены пути деградации флуорена, аценафтена, аценафтилена, фенантрена, антрацена, флуорантена и пирена; эти ПАУ использовались как субстраты в практической части работы.

Метаболизм флуорена Трансформацию флуорена способны осуществлять бактерии различной систематической принадлежности. Описан ряд штаммов грамположительных (Grifoll et al., 1992; Trenz et al., 1994; Monna et al., 1993; Boldrin et al., 1993) и грамотрицательных (Grifoll et al., 1994; Resnick et Gibson, 1996) бактерий, способных превращать флуорен. Некоторые штаммы растут в среде с флуореном в качестве единственного источника органического углерода, получая энергию исключительно в результате окисления флуорена (Grifoll et al., 1992). В отдельных случаях происходит полная деградация молекулы флуорена до углекислого газа и воды (Grifoll et al., 1994). Особенностью флуорена, как и других нафтеноароматических соединений, является высокая реакционная способность метиленовой группы. Флуорен легко окисляется по С9 в флуоренол и далее в флуоренон. Эту трансформацию осуществляют многие бактерии и грибы (Casellas et al., 1998). Нафталиндиоксигеназа из Pseudomonas sp. NCIB 9816 окисляет флуорен в 3,4-дигидродиол, но дает в качестве побочного продукта несколько процентов флуоренола (Resnick et Gibson, 1996). Существует два принципиально различных пути деградации флуорена бактериями: путь, начинающийся с окисления ароматического кольца, и путь, начинающийся с окисления метиленовой группы. В первом случае происходит окисление и расщепление одного из ароматических колец флуорена, аналогичное реакциям расщепления ароматического кольца у других ПАУ, приводящее к производным индана. Кольцо может окисляться по 3-4 -связи (рис. 1.2А), либо 1-2 -связи (рис. 1.2Б), оба варианта реализованы у штамма Arthrobacter sp. F101 (Casellas et al, 1997). Если процесс начинается с окисления метиленовой группы, в качестве интермедиата образуется флуоренон, который затем подвергается необычной реакции углового окисления (angular dioxygenation) и разрыву метиленового мостика с образованием производного дифенила, последующие реакции напоминают бактериальный метаболизм дифенила (рис. 1.2В). Путь реализован у Brevibacterium sp. DPO 1361 (Trenz et al, 1994), Pseudomonas sp. F204 (Grifoll et al, 1994), а также (кроме двух первых реакций) у штамма Pseudomonas mendocina МС2, использующего в качестве ростового субстрата флуоренон (Casellas et al, 1998). Метаболизм гетероциклических аналогов флуорена (дибензофурана, дибензотиофена и карбазола) аналогичен метаболизму флуорена (Bressler et Fedorak, 2000)

Культивирование штаммов, осуществляющих деградацию и трансформацию полиароматических углеводородов

В работе использовались штаммы Rhodococcus rhodochrous 172, R. opacus 4a. R. opacus 557, R.rhodnii 135 и Pseudomonas fluorescens 26k, отобранные из коллекции деструкторов ксенобиотиков лаборатории энзиматической деградации органических соединений по способности к превращению ПАУ, а также 3 новых штамма