Молоко как фактор передачи возбудителя кишечного иерсиниоза Осипчук Екатерина Сергеевна

В последние 30 лет пристальное внимание эпидемиологов, бактериологов и инфекционистов привлекает проблема кишечного иерсиниоза -зооантропонозного заболевания, при котором источником инфекции являются сельскохозяйственные, домашние и дикие животные. Факторы передачи - пищевые продукты, в основном животного происхождения (молоко и молочные продукты, мясо и мясные продукты), употребляемые в пищу в сыром виде или хранившиеся при низкой температуре (Онищенко, 1999).

Возбудителю кишечного иерсиниоза особое внимание уделено в международной программе ФАО / ВОЗ по безопасности пищевых продуктов, созданной в рамках ООН (Ленченко, 2002).

Это обусловлено широким распространением возбудителя кишечного иерсиниоза во всем мире. Кишечный иерсиниоз регистрируется более чем в 30 странах: в Европе, США, Канаде, Бразилии, Южной и Северной Африке, Японии, Ираке, Израиле и др. (Ющенко, 1998; 1999). Особенно часто болезнь выявляют в крупных городах с развитой пищевой промышленностью и высоким экономическим уровнем, на территориях с умеренным климатом (Шувалова, 1982; Воронов, 1989).

В Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниозы по уровню заболеваемости населения занимают 3 место после сальмонеллеза и кампилобактериоза (Bockemuhl, 1995; Ленченко, 2000; Васильев, Померанцев, Золотухин, 2000). В странах, где налажена диагностика, на долю иерсиниоза приходится 4 % всех пищевых токсикоинфекций (Ленченко ,2000). В Российской Федерации по данным республиканских информационно - медицинских центров иерсиниозы занимают 2 место после сальмонелезов (Черкасский, Подунова, Акулова, 1995; Померанцев, Васильев, 1998). В некоторых странах иерсиниозы превосходят по распространению сальмонеллез, колибактериоз и шигеллез (Шумилов, Мельниченко, Селиверстов, 1998).

На долю иерсиниоза и псевдотуберкулеза приходится 3-15 % ОКИ (Хакимов, 1999; Косенко, 1999). В последние годы наблюдается выраженная тенденция к увеличению числа заболеваний иерсиниозами, причем нередко данные являются заниженными из-за недостаточно полной их регистрации (Ленченко, 2002; Зайцев, Маненкова, 1999).

В настоящее время заболеваемость людей иерсиниозом составляет 0,3-3,9 на 100 тыс. населения, а псевдотуберкулезом 0,1-8,9 в различных климатических зонах (Ющенко, 1998)

Исследования животных на кишечный иерсиниоз в нашей стране до последнего времени не проводились, и лишь в 1996 г. эта инфекция была включена в перечень официально регистрируемых (СП 3.1.084-96, ВП 13.3.4.1100-96).

При кишечном иерсиниозе особую опасность представляют собой обсемененые иерсиниями пищевые продукты животного происхождения-

7 потенциальные факторы передачи бактерий. Они могут быть контаминированы на всех этапах получения, хранения и реализации, от животного до прилавка магазина (Покровский, 1993; Ющенко, 1997;

По данным ряда исследователей серопозитивными в отношении Y.enterocolitica являются от 34,5 до 66,8 % молочных коров (Колос, Гнутов, Ющенко, 1985; Ющенко, 1986; Гурлева, 1987), 6-49 % свиней (Померанцев, Васильев, 1998; Собакин, Зыкин, Хапцев, 1998), овец от 9,5 % до 31,8 % (Колос, Гнутов, Ющенко, 1985; Степанов, 1986; Тихонов, 1999).

Иерсинии высевают от домашних животных, птиц, рыб, грызунов (Тимофеева, 1986; Ющенко, 1997; 1998; Некрасова, 1999).

Особенно важно, что Y.enterocolitica выделяется от 11-14 % коров, как с клиническими признаками иерсиниоза, так и при латентном течении болезни (Степанов, 1980; Ющук, Кареткина, Ценева, 2000).

Иерсинии обнаружены в 20 % проб сырого молока, в 7-9 % проб пастеризованного молока (Померанцев, Васильев, 1998; Ющенко, 1998), в 35,8 % проб пастеризованного молока (Кузнецов, Багрянцев, 1992), в 6 % проб пастеризованных сливок (Ошейкр, Панькова, 1997), а также в мясе и мясных продуктах, птице, яйце, овощах и фруктах (Гордейко, 1990; Невенчаная, 1997; Ющенко, 1998; Березкина, 2001). Y.enterocolitica обнаруживается на различных объектах окружающей среды и в питьевой воде (Березкина, 2001; Покровский, 1986; 1993).

Проблема иерсиниоза была признана ВОЗ глобальной (WHO report, 1980,

Л.М. Ошейкр и Р.Н. Панькова (1997) считают, что "Санитарные правила для предприятий молочной промышленности" № 4431-87 от 12.10.87 не обеспечивают очищения молочных продуктов от возбудителя кишечного иерсиниоза. Поэтому проблема совершенствования существующих режимов пастеризации остается актуальной в настоящее время.

Заболеваемость иерсиниозом привлекает пристальное внимание органов здравоохранения и санэпидслужбы, так как болезнь наносит большой экономический ущерб (1 млрд. 208 млн. руб. только по Москве за 1997) и характеризуется тяжелым клиническим течением, возникновением рецидивов, трудностью клинической диагностики и возникновением групповых очагов (Зайцев, Маненкова, 1999; Ленченко, 2002).

В Саратовской области иерсиниоз сельскохозяйственных животных был обнаружен Л.Ф. Зыкиным и соавт. (1997). Роль пищевых продуктов как факторов передачи иерсиниозной инфекции не изучалась.

Целью работы явилось изучение распространения кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в Саратовской области и выяснение роли молока и молочных продуктов как факторов передачи возбудителя при иерсиниозной инфекции.

1. Исследовать сборные и индивидуальные пробы молока КРС

9 хозяйств Саратовской области на наличие возбудителя кишечного иерсиниоза.

Определить эффективность существующих режимов пастеризации молока для освобождения от Y.enterocolitica.

Изучить выживаемость кишечных иерсиний в некоторых кисло -молочных продуктах и сырах.

Апробировать ПЦР для обнаружения ДНК Y.enterocolitica в молоке КРС хозяйств, в которых ранее неоднократно выделялся возбудитель кишечного иерсиниоза.

Впервые в Саратовской области установлен факт обнаружения вирулентных штаммов Y.enterocolitica в молоке КРС нескольких хозяйств, то есть подтверждена важная роль молока в передаче кишечных иерсиний.

Впервые доказано, что в некоторых сортах мягких сыров происходит размножение и накопление возбудителя кишечного иерсиниоза и, следовательно, эти виды сыров могут играть важную эпидемиологическую роль.

Установлено, что ПЦР является эффективным методом индикации Y.enterocolitica в молоке и по информативности существенно превосходит общепринятый бактериологический метод.

10 Практическая значимость

Выявлен стойкий очаг кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных в Петровском районе Саратовской области с помощью бактериологического метода.

Установлено, что сроки выживания Y. enter-ocolitica в кисломолочных продуктах и сырах твердых сортов не превышают 3-4 суток, тогда как в мягких сырах идет активное размножение иерсиний. Это позволяет оценить мягкие сыры как возможный фактор передачи возбудителя при кишечном иерсиниозе.

ПЦР, является в два раза более информативной чем бактериологический метод и позволяет сократить время исследования до 5 - 6 часов вместо 2 -3 недель при использовании бактериологического и рекомендуется в качестве экспресс - метода при выявлении иерсиний в молоке.

По результатам исследований подготовлены «Методические рекомендации по индикации возбудителя кишечного иерсиниоза в молоке методом полимеразной цепной реакции», утвержденные УМС ИВМиБ

ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» (протокол № 20 от

20 декабря 2002г.).

Материалы диссертации вошли в монографию Л.Ф. Зыкина и соавт. «Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйственных животных», Саратов, 2002, а также используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и ВСЭ ИВМиБ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И.

На защиту выносятся следующие положения

Показано распространение кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в Саратовской области.

Изучена выживаемость Y. enterocolitica в некоторых кисломолочных продуктах и сырах.

ПЦР рекомендуется для индикации Y.enterocolitica в молоке КРС.

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» в соответствии с плановой тематикой: «Разработка и внедрение эффективных методов дифференциальной диагностики туберкулеза, кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулеза, листериоза и лейкоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области» (2001). «Роль сельскохозяйственных животных в распространении некоторых бактериальных и вирусных инфекций в Саратовской области» (2002).

Материалы диссертации доложены на «Научных конференциях

12 профессорско - преподавательского состава и аспирантов СГАУ по итогам научно - исследовательской работы за 2001 и 2002 г.г.», а также на «Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов СГАУ, посвященной

115 - летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова» (2003).

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2001 - 2002 г.г.

По материалам диссертации опубликованы 4 работы в отечественной литературе.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованных литературных источников и приложения. Материалы диссертации изложена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрированы 14 таблицами и 5 рисунками. Список использованных литературных источников включает 196 наименований, в том числе 59 зарубежных.

Основные свойства возбудителя

Y. enterocolitica представляет собой палочки с закругленными концами длиной 0,8 - 1,5 мкм и шириной 0,5 - 1,0 мкм в зависимости от возраста культуры, температуры и среды культивирования. Грамотрицательные, часто окрашиваются биполярно. Подвижны при температуре не выше 25 С, имеют перитрихиально расположенные жгутики и фимбрии по всей поверхности бактериальной клетки (Водопьянов, Родионова, 1984; Maclagan, 1980; Мартиневский, 1986). При особых условиях культивирования могут образовывать капсульную субстанцию. Спор не образуют (Шувалова, 1982; Лобзина ,2000).

Иерсинии факультативные анаэробы. Неприхотливы и нетребовательны к питательным средам, растут на обычных средах (МПА, агар Хоттингера и Мартена), на средах для выделения энтеробактерий (среды Эндо, Левина). Хорошо развиваются на кровяном и шоколадном агаре, на специальных дифференциально - диагностических средах (среда с бромтимоловым синим, ИПС, среда Серова), а также на бедных средах (ФБР, 1 % ЗПВ) (Ющенко, 1984; Покровский, 1986).

Для иерсинии оптимальная рН 7,2 - 7,4, наиболее благоприятная температура роста 22 - 28 С, при 37 С часто диссоциируют в R - формы, активно размножаются в диапазоне температур от 4 до 14 С, при 40 С рост прекращается (Конопаткин, Артемов, Баракулов, 1993; Покровский, 1999).

На жидкой среде через сутки культивирования иерсинии образуют равномерное помутнение и осадок, поднимающийся при встряхивании в виде косички, могут образовывать пленку на поверхности среды или пристеночное кольцо. R - формы дают рост в виде осадка, среда остается прозрачной (Шувалова, 1982; Фролов, 1987).

На МПА и агаре Хоттингера через сутки при 22 - 28 С иерсинии образуют мелкие (0,1 -0,5 мм в диаметре) круглые, выпуклые, бесцветные, полупрозрачные, блестящие колонии с ровным краем, мягкой консистенции, имеющие голубоватый оттенок в проходящем свете. Через 36 -48 часов колонии теряют прозрачность и голубоватый оттенок, может быть сливной рост (Ценева, 1997). При культивировании при 37 С колонии мелкие, непрозрачные, с неровным краем - R - формы (Смирнов, Ценева, 1991). На среде Эндо иерсинии образуют мелкие, росинчатые, круглые, выпуклые, блестящие, бесцветные колонии с ровным краем и розоватым центром. На вторые сутки колонии увеличиваются в диаметре и могут приобретать розоватый оттенок. На среде Левина вырастают колонии неправильной формы от темно - фиолетового до светло - синего цвета (Гурлева, Колпикова, 1989; Покровский, 1999).

На среде ИПС образуют через сутки мелкие желтые колонии с потемнением среды вокруг них, на вторые сутки колонии и среда приобретают сине - зеленый цвет. Края колоний волнистые, центр приподнят.

При определенных условиях (наличие в среде пенициллина или стрептомицина, хлорида лития и, особенно, метионина) способны образовывать L - формы (Ющенко, 1984; Pease, 1979), а также протопласты и сферопласты (Дзадинева, 1987).

У вирулентных штаммов иерсинии (0:3 серотипа) описана способность образовывать зону Р - гемолиза на агаре с добавлением 5- 10 % бычьей или бараньей крови при температуре 22 С (Pedersen, 1981; Бондаренко, Голубев, 1988). 1.3. Биохимические свойства возбудителя кишечного иерсиниоза Y.enterocolitica обладает широким спектром ферментов, обеспечивающих питательные и энергетические потребности, а также возможность существовать в различных условиях, в том числе во внешней среде. Возбудитель кишечного иерсиниоза не образует сероводород, не разжижает желатин, не образует фермент оксидазу и лизиндекарбоксилазу, не обладает способностью дезаминировать фенилаланин и утилизировать цитрат Симмонса, не разлагает Д - арабинозу, дульцит, инулин, L - ксилозу, лактозу, мелибиозу. Y.enterocolitica выделяет индол, образует ферменты уреазу, каталазу, нитратредуктазу,